Een dierlijk model is nodig om het ontcijferen van de rol van circulerende tumorcellen (CTCs) bij de bevordering van longkanker kolonisatie tijdens kanker uitzaaiingen. Hier, we vastgesteld en met succes uitgevoerd een in vivo assay op specifiek proef de eis van polymere fibronectine (polyFN) vergadering over CTCs voor longkanker kolonisatie.
Metastase is de belangrijke doodsoorzaak kanker. De rol van circulerende tumorcellen (CTCs) biij van uitzaaiing van de kanker, waarin Long kolonisatie door CTCs kritisch aan de vroege Long metastatische processen bijdraagt, heeft krachtig onderzocht. Als zodanig, zijn dierlijke modellen de enige aanpak die de volledige systemische proces van metastase vangt. Gezien het feit dat er zich problemen in eerdere experimentele designs voordoen voor de behandeling van de bijdragen voor CTCs aan bloedvat extravasation, we een in vivo -bepaling van het Long-kolonisatie vastgesteld waarin een lange-termijn-fluorescentie cel-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), werd gebruikt voor het label van de geschorste tumorcellen en longkanker perfusie Schakel niet-specifiek gevangen CTCs voorafgaand aan longkanker verwijdering, confocal imaging en kwantificering werd uitgevoerd. Polymere fibronectine (polyFN) is geassembleerd op CTC oppervlakken is gebleken te bemiddelen Long kolonisatie in de uiteindelijke oprichting van uitgezaaide tumor weefsels. Hier, als u wilt specifiek testen de eis van polyFN vergadering op CTCs voor longkanker kolonisatie en extravasation, we korte termijn uitgevoerd Long kolonisatie testen waarin geschorst Lewis lung carcinoma cellen (LLCs) stabiel uiten FN-shRNA (shFN) of Scramble-shRNA (shScr) en vooraf gelabeld met 20 μM van CFSE waren intraveneus geënt in C57BL/6 muizen. Wij succesvol gebleken dat de capaciteiten van shFN LLC cellen te koloniseren de muis longen werden aanzienlijk verminderd ten opzichte van shScr LLC cellen. Daarom kan dit op korte termijn methodologie algemeen worden toegepast om aan te tonen specifiek de mogelijkheid voor CTCs binnen het verkeer om te koloniseren de longen.
Metastase is de belangrijkste oorzaak van kanker overlijden1,2. Tumorcellen uit primaire weefsels verkregen Voer het verkeer in suspensie en overleven van verschillende hematogene uitdagingen, bijvoorbeeld, anoikis, immuun aanvallen en schade als gevolg van de shear stress van bloeddruk of geometrische beperkingen, voordat ze zijn kundig voor koloniseren verre organen, een belangrijke stap die het succes van metastase3,,4,,5,6te dicteren. Daarom, krachtige inspanningen momenteel gedaan in karakterisering van circulerende tumorcellen (CTCs) en het correleren van deze kenmerken met maligniteit van de tumor, uitzaaiingen en overlevingskansen bij kanker patiënten7,8 , 9. aangezien het proces van uitzaaiing van kanker specifiek een in vivo -evenement toont, dierlijke modellen zijn de enige aanpak die de volledige systemische proces van metastase10,11,12 vangt .
CTCs geworden uitgezaaide tumor weefsels via meerdere cellulaire gebeurtenissen met inbegrip van de kolonisatie van verre organen1,2. Echter, de meest gebruikte metastase assays13,14,15 bieden niet een manier om het observeren van CTC kolonisatie van verre organen. Een in vivo test ontwerp voor CTC kolonisatie visualisatie is daarom dringend noodzakelijk. Hoewel verschillende in vivo en ex vivo korte blijven termijn Long kolonisatie testen zijn ontworpen, problemen en nadelen. Bijvoorbeeld, terwijl groene fluorescentie proteïne (GFP)-overexpressing tumor cellen zijn gebruikt in deze testen22,23, het kost tijd om stabiel transfect en kloon van tumorcellen met voldoende GFP fluorescerende intensiteit onder de Microscoop. Evenzo, voorbijgaande kleuring van tumorcellen met de lange termijn cel tracer CFSE is werkzaam ter vervanging van de tumorcellen GFP-uitdrukken, maar nog steeds moeilijk te beoordelen of de CFSE-geëtiketteerden tumorcellen zijn gekoppeld of alleen aanwezig binnen de therapieën voor de verwijderde verre organen16,17.
Polymere fibronectine (polyFN) is geassembleerd op oppervlakken voor CTCs is gebleken dat kritisch bijdragen tot de uiteindelijke oprichting van uitgezaaide tumor weefsels18,19,20,21,22 . Hier, we uitgevoerd korte termijn Long kolonisatie testen die in zwevende Lewis lung carcinoma cellen (LLCs) stabiel uiting van FN-shRNA (shFN) of scramble-shRNA (shScr) en vooraf gemarkeerd met CFSE intraveneus in C57BL/6 muizen geënt werden. Na 2-3 dagen, werden muis longen eerst geperfundeerd met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor het verwijderen van niet-vastgemaakte CTCs binnen de therapieën alvorens te worden onderworpen aan confocale microscopie en kwantificering van LLCs Long-koloniseren. We toonden duidelijk dat het aantal Long-koloniseren shFN LLCs en tumor knobbeltjes aanzienlijk werden verminderd in vergelijking met shScr LLCs, aanzienlijk ondersteunend de rol van polyFN vergadering op CTCs in het vergemakkelijken van de kolonisatie en de groei van CTCs in de longen. Onze studie nog verdere onderzoek voor de rol van polyFN in kanker uitzaaiingen.
Samen met de lange termijn Long kolonisatie testen, korte termijn methodologie we hier gebruikt om te evalueren in vivo Long kolonisatie door CTCs in verre organen duidelijk onthuld en de specifieke rol van polyFN gemonteerd op CTCs in koloniseren gedifferentieerd de longen, wat vervolgens tot de extravasation en metastatische processen18,19,20,21 leidde. Hoewel cellen met lange termij…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank Dr. Ming-Min Chang en Ms. Ya-Hsin Cheng voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en de technologie van Taiwan (meeste-103-2325-B-006-009, meeste-104-2325-B-006-001, meeste-105-2325-B-006-001 en MOST-106-2320-B-006-068-MY3) en het ministerie van volksgezondheid en welzijn (MOHW106-TDU-B-211-144004). Wij zijn ook dankbaar voor de steun van het onderzoekslaboratorium van de kern van de College of Medicine, National Cheng Kung University, voor hun multi foton confocal microscoop.
Material | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |