JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

Published: June 16, 2018
doi:
10.3791/56761
, , , , , ,
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine,National Cheng Kung University, 3Trauma Office,Children’s National Health System

Summary

במודל חיה יש צורך לפענח את התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום קולוניזציה ריאות במהלך גרורות סרטן. . הנה, הקמנו, לבצע בהצלחה של ויוו assay לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבה fibronectin פולימריים (polyFN) על CTCs ריאות קולוניזציה.

Abstract

גרורות הוא הגורם העיקרי של מקרי המוות מסרטן. התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום גרורות סרטן, שבו הריאות קולוניזציה על-ידי CTCs אנושות תורם לתהליכים מוקדם ריאות גרורתי, נחקר נמרצות. ככזה, מודלים בעלי חיים הם הגישה היחידה כי לוכדת את תהליך מערכתי מלא של גרורות. בהתחשב בכך להתרחש בעיות קודמות עיצובים ניסיוני לבחינת התרומות של CTCs כדי extravasation כלי דם, הקמנו ויוו ריאות קולוניזציה assay שבו תא-מעקב ארוך-טווח-זריחה, carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE), שימש לה תווית תאים סרטניים מושעה, זלוף ריאות בוצע כדי לנקות הלא ספציפית לכוד CTCs לפני הסרת הריאה, הדמיה קונאפוקלית ו כמת. Fibronectin פולימריים (polyFN) התאספו על משטחים CTC נמצאה לתווך ריאות קולוניזציה בהקמה הסופי של רקמות גידול גרורתי. . כאן, כדי לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבות polyFN CTCs ריאות קולוניזציה, extravasation, ביצענו לטווח קצר ריאות מבחני קולוניזציה שבו הושעה לואיס ריאות קרצינומה של תאים (LLCs) stably לבטא FN-shRNA (shFN) או לטרוף-shRNA (shScr) ומתויגים מראש עם 20 μM של CFSE חוסנו לווריד לתוך עכברים C57BL/6. בהצלחה להדגים היכולות של shFN LLC תאים ליישב הריאות העכבר היו פחתה באופן משמעותי בהשוואה shScr LLC תאים. לכן, מתודולוגיה לטווח קצר זו עשוי להיות מיושם באופן נרחב להפגין באופן ספציפי את היכולת של CTCs בתוך מחזור הדם ליישב את הריאות.

Introduction

גרורות הוא הגורם העיקרי של סרטן מוות1,2. תאים סרטניים נגזר רקמות הראשי להזין את זרימת הדם ההשעיה ולשרוד שונים אתגרים hematogenous למשל, anoikis, התקפות מערכת החיסון, נזקים עקב מאמץ גזירה לחץ דם או אילוצים גיאומטריים, לפני שהם אפשרות ליישב איברים רחוקים, צעד. מפתח מכתיב את ההצלחה של גרורות3,4,5,6. לכן, נמרצת כרגע נעשו מאמצים איפיון תאים סרטניים במחזור (CTCs), מתאם מאפיינים אלו עם גידול ממאיר, גרורות, שיעורי ההישרדות של סרטן המטופלים7,8 , 9. מאז התהליך של גרורות סרטן במיוחד מתארת אירוע ויוו , מודלים בעלי חיים הם הגישה היחידה כי לוכדת את תהליך מערכתי מלא גרורות10,11,12 .

CTCs הופכים גידול גרורתי לרקמות דרך הסלולר אירועים מרובים כולל הקולוניזציה של איברים רחוקים1,2. עם זאת,14,15 13,מבחני גרורות הנפוצות ביותר אינם מספקים דרך להתבונן CTC קולוניזציה של איברים רחוקים. לכן, עיצוב assay ויוו להמחשת קולוניזציה CTC דרוש בדחיפות. למרות מספר ויוו , שמחוץ קצר לטווח הריאה קולוניזציה מבחני עוצבו, בעיות, חסרונות נשארים. למשל, בעוד חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP)-מבחני overexpressing גידול תאים השתמשו באלה22,23, זה לוקח זמן stably transfect, לשכפל תאים סרטניים בעוצמה מספקת GFP פלורסנט תחת המיקרוסקופ. באופן דומה, למרות מכתים ארעית של תאים סרטניים עם חיצי מעקב התא לטווח ארוך CFSE ננקטה כדי להחליף את תאי הגידול לבטא-GFP, זה נשאר קשה לשפוט אם בתאי הגידול התווית על-ידי CFSE מחוברים או סתם מתנה בתוך להערכת מתוך16,נכרת איברים רחוקים17.

Fibronectin פולימריים (polyFN) התאספו על משטחים של CTCs נמצאה לתרום באופן ביקורתי הממסד הסופי של גידול גרורתי רקמות18,19,20,21,22 . כאן, נוכל לבצע לטווח קצר ריאות קולוניזציה מבחני שבו תנאי לואיס ריאות קרצינומה של תאים (LLCs) stably FN-shRNA (shFN) או לטרוף-shRNA (shScr) ומוענקת לו מראש CFSE חוסנו לווריד לתוך עכברים C57BL/6. לאחר 2-3 ימים, הריאות העכבר היו קודם perfused בתמיסת פוספט buffered (PBS) כדי להסיר לחלוטין את CTCs כעיגולים בצבע בתוך להערכת לפני נתון מיקרוסקופיה קונפוקלית, כימות של הריאות-להמדינות LLCs. אנחנו הראו בבירור המספרים של הריאות-להמדינות shFN LLCs ואת הגידול גושים הצטמצמו באופן משמעותי בהשוואה shScr LLCs, באופן משמעותי מאמתים את התפקיד של הרכבות polyFN CTCs בקידום קולוניזציה של צמיחה של CTCs ב הריאות. המחקר שלנו דורש עוד חקירה לתפקיד של polyFN של גרורות סרטן.

Protocol

כל הניסויים על עכברים בוצעו בהתאם לקווים המנחים של המכון שלנו (המדריך לקבלת טיפול, שימוש של חיות מעבדה, המכללה לרפואה NCKU). 1. הכנת כלי נגינה, תרבות המדיה ומנות לפני שמתחילים את הפרוטוקולים ניסיוני, להשיג את התפרים כירורגי סטרילי, 1 מ”ל מזרקים עם מחט 26G/0.5 ס מ (על הזנב זריקה ל?…

Representative Results

לפני שתבצע ויוו ריאות קולוניזציה וזמינותו כמופיע ב איור 1A כדי לבדוק אם polyFN על תאים סרטניים מושעה שמתווכת קולוניזציה ריאות ו/או extravasation בקידום גרורות, אנחנו קודם, טיטרציה שונים ריכוזי CFSE, תרכובת פלורסנט תא חדיר, covalently conjugates תאיים amine המכילים מולקולות<su…

Discussion

יחד עם זמן לטווח הריאה קולוניזציה מבחני, לטווח הקצר מתודולוגיה אנחנו מועסק כאן כדי להעריך ויוו ריאות קולוניזציה מאת CTCs באיברים מרוחקים בבירור חשפה ו הבדיל את תפקיד ספציפי polyFN התאספו על CTCs להמדינות הריאות, אשר לאחר מכן הוביל extravasation ואת התהליכים גרורתי18,19</…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות מינג-מין ד ר צ’אנג וצ’אנג יה-חסין גב’ לתמיכה טכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (לרוב-103-2325-B-006-009, רוב-104-2325-B-006-001, רוב-105-2325-B-006-001, MOST-106-2320-B-006-068-MY3) משרד הבריאות ואת הרווחה (MOHW106-TDU-B-211-144004). אנחנו גם תודה על התמיכה של המעבדה לחקר הליבה של המכללה לרפואה, האוניברסיטה הלאומית צ’נג קונג, מיקרוסקופ קונפוקלי שלהם פוטון מרובה.

Materials

Material
Bovine Serum Albumin (BSA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-9048-46-8
Bouin's Fluid MCC(medical chemical corporation)/POISON 456-A-1GL
CFSE Proliferation Dye ebiosciences 65-0850-85 Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)  (Gibco)ThermoFisher Scientific 12100-061
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-6381-92-6 For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) 
Fetal bovine serum (FBS) (Gibco)ThermoFisher Scientific 10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC) ATCC, Manassas, VA, USA CRL-1642
L-Glutamine, USP  (Gibco)ThermoFisher Scientific 21051-024
Potassium chloride (KCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7447-40-7 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7778-77-0 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )
Sodium chloride (NaCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7647-14-5 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-10039-32-4 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )
Trypan Blue Sigma Aldrich T6146 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS
Trypsin Sigma Aldrich T4799 For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )
Zoletil 50 Virbac To dilute with 1X PBS 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420 KUBOTA Co. 2420
Culture dish (6cm) Wuxi NEST Biotechnology Co. 705001
Disposable syringe (with needle) Perfect Medical Industry Co. 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixer C.T.I YOUNG CHENN TS-20 For suspended cells recovery 
FACSCalibur (FACS) BD biosciences
Forceps Dimeda 10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc. HEPA CLASS 100
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) Stoelting 51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI Olympus FV1000MPE
Neubauer counting chamber Marienfeld-Superior 640010
Surgical scissor Dimeda 08.370.11
Surgical sutures  UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. NO. 0034 Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifuge tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001
15 mL Greiner tube Greiner bio-one 188271
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells – mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
  4. Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  5. Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
  6. Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
  7. Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  8. Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
  9. Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
  10. Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
  11. Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
  12. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
  13. van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
  14. Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
  15. Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
  16. von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
  17. Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
  18. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
  19. Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
  20. Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
  21. Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
  22. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
  23. Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
  24. Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
  25. Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
  26. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  27. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  28. Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
  29. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  30. Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
  31. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  32. Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
  33. Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
  34. Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
  35. Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
  36. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
  37. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  38. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  39. Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
  40. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  41. Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
  42. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  43. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  44. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  45. Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
  46. Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
  47. Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
  48. Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
  49. Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
  50. Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
  51. Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
  52. Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
  53. Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
  54. Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
  55. Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
  56. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  57. Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
  58. Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
  59. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  60. Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
  61. Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
  62. Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).

Tags

Lung ColonizationCirculating Tumor CellsCancer MetastasisCell VisualizationCell CultureTrypsin-EDTACell SuspensionCentrifugationCFSETail Vein InjectionC57BL/6 Mouse

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Lin, T., Liao, Y., Chang, W., Yang, C., Cheng, L., Cheng, M., Cheng, H. The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues. J. Vis. Exp. (136), e56761, doi:10.3791/56761 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image