JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

Inrättandet av en Lung Colonization analys för cirkulerande tumör Cell visualisering i lungvävnad

Published: June 16, 2018
doi:
10.3791/56761
, , , , , ,
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine,National Cheng Kung University, 3Trauma Office,Children’s National Health System

Summary

En djurmodell som behövs för att dechiffrera rollen av cirkulerande tumörceller (CTCs) att främja lung koloniseringen under cancer metastaser. Här vi etablerat och framgångsrikt utfört en i vivo assay specifikt prov kravet på polymera Fibronektin (polyFN) montering på CTCs för lung kolonisering.

Abstract

Metastaser är den största orsaken till dödsfall i cancer. Rollen av cirkulerande tumörceller (CTCs) att främja cancer metastaser, där lungan koloniseringen av CTCs kritiskt bidrar till tidig lungcancer metastaserande processer, har undersökts kraftigt. Som sådan, är djurmodeller den enda strategi som fångar full systemisk processen av metastaser. Med tanke på att det uppstår problem i tidigare experimentell design för att undersöka CTCs bidrag till blodkärl extravasering, vi etablerat ett koloniseringen i vivo lung test där en lång-sikt-fluorescens cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), användes att märka svävande tumörceller och lung perfusion utfördes för att rensa icke-specifikt fångade CTCs före lung borttagning, confocal imaging och kvantifiering. Polymera Fibronektin (polyFN) monteras på CTC ytor har konstaterats för att medla lung kolonisationen i det slutliga inrättandet av metastaserande tumör vävnader. Här, för att specifikt testa kravet på polyFN montering på CTCs för lung koloniseringen och extravasering, vi utfört kort sikt lung colonization analyser där svävande Lewis lung carcinom celler (LLCs) stabilt uttrycker FN-shRNA (shFN) eller Scramble-shRNA (shScr) och pre märkt med 20 μM av CFSE var intravenöst inokuleras i C57BL/6 möss. Vi har framgångsrikt visat att shFN LLC celler förmåga att kolonisera mus lungorna minskades avsevärt i jämförelse med shScr LLC celler. Därför kan denna kortsiktiga metod tillämpas allmänt för att specifikt Visa förmåga för CTCs inom cirkulationen att kolonisera lungorna.

Introduction

Metastaser är den största orsaken till cancer döden1,2. Tumörceller som härrör från primära vävnader ange cirkulationen i suspension och överleva olika hematogen utmaningar, t.ex., anoikis, immun anfallar och skadestånd på grund av shear stress från blodtryck eller geometriska begränsningar, innan de är kunna kolonisera avlägsna organ, ett viktigt steg diktera framgången av metastaser3,4,5,6. Därför har krafttag för närvarande gjorts i kännetecknar cirkulerande tumörceller (CTCs) och korrelera dessa egenskaper med tumör malignitet, metastaser och överlevnaden av cancer patienter7,8 , 9. eftersom processen för cancer metastaser skildrar specifikt en in-vivo -händelse, djurmodeller är den enda strategi som fångar processen full systemiska metastas10,11,12 .

CTCs blivit metastaserande tumör vävnader genom flera cellulära händelser inklusive koloniseringen av avlägsna organ1,2. Den vanligaste metastaser analyser13,14,15 ger dock inte ett sätt att observera CTC koloniseringen av avlägsna organ. Därför behövs omgående en i vivo test design för CTC colonization visualisering. Även om flera i vivo och ex vivo kort kvarstår sikt lung colonization analyser har utformats, problem och nackdelar. Till exempel, medan grönt fluorescerande protein (GFP)-överuttryck av tumör celler har använts i dessa analyser22,23, det tar tid att stabilt transfect och klona tumörceller med tillräckligt god Jordbrukarsed fluorescerande intensitet under mikroskopet. På samma sätt även om övergående färgning av tumörcellerna med den långsiktiga cell tracer CFSE har använts för att ersätta tumörcellerna GFP-uttryckande, det fortfarande svårt att bedöma huruvida CFSE-märkt tumörcellerna är kopplade eller bara finns inom den vaskulatur av exciderad avlägsna organ16,17.

Polymera Fibronektin (polyFN) monteras på ytor av CTCs har befunnits kritiskt bidra till det slutliga inrättandet av metastaserande tumör vävnader18,19,20,21,22 . Här, utfört vi kort sikt lung colonization analyser där svävande Lewis lung carcinom celler (LLCs) stabilt uttrycker FN-shRNA (shFN) eller scramble-shRNA (shScr) och pre märkt med CFSE var intravenöst inokuleras i C57BL/6 möss. Efter 2-3 dagar, var mus lungorna först perfusion med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) att helt ta bort lös CTCs inom vaskulatur innan utsätts konfokalmikroskopi och kvantifiering av lung-kolonisera LLCs. Vi visade tydligt att de antal lung-kolonisera shFN LLCs och tumör knölar minskade betydligt jämfört med shScr LLCs, väsentligen bekräftar polyFN montering på CTCs roll i att underlätta kolonisation och tillväxten av CTCs i den lungorna. Vår studie motiverar ytterligare utredning för rollen av polyFN i cancer metastaser.

Protocol

Alla experiment på möss utfördes enligt riktlinjerna för vår institute (Handbok för skötsel och användning av försöksdjur, NCKU Medical College). 1. beredning av instrument, kultur Media och rätter Innan du börjar de experimentella protokoll, få sterila kirurgiska suturer, 1 mL sprutor med 26G/0,5 cm nål (för svans ven injektion), 3 mL sprutor med 24G 3 cm nål (för lung perfusion), Dulbeccos modifierade Eagle Media (DMEM), trypsin-EDTA-lösning (5 Redov trypsin och 0…

Representative Results

Innan du kan utföra i vivo lung colonization analysen som illustreras i figur 1A att testa om polyFN på svävande tumörceller förmedlar lung koloniseringen och/eller extravasering att underlätta metastaser, titreras vi först olika koncentrationer av CFSE, en fluorescerande förening som är cellen genomsläpplig och kovalent konjugat intracellulära amine-innehållande molekyler26,27 i …

Discussion

Tillsammans med lång sikt lung colonization analyser, på kort sikt metodik vi anställd här för att utvärdera i vivo lung koloniseringen av CTCs i avlägsna organ tydligt Avtäcka och differentierade polyFN monteras på CTCs kolonisera specifika roll lungorna, som sedan ledde till extravasering och metastaserande processer18,19,20,21. Även om märkning celler med lång sikt cell …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Dr Ming-Min Chang och Ms. Ya-Hsin Cheng för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av Taiwans ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta-103-2325-B-006-009, de flesta-104-2325-B-006-001, de flesta-105-2325-B-006-001 och MOST-106-2320-B-006-068-MY3) och ministeriet för hälsa och välfärd (MOHW106-TDU-B-211-144004). Vi är också tacksamma för stödet från Core forskningslaboratorium för College of Medicine, National Cheng Kung University, för deras flera photon confocal mikroskopet.

Materials

Material
Bovine Serum Albumin (BSA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-9048-46-8
Bouin's Fluid MCC(medical chemical corporation)/POISON 456-A-1GL
CFSE Proliferation Dye ebiosciences 65-0850-85 Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)  (Gibco)ThermoFisher Scientific 12100-061
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-6381-92-6 For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) 
Fetal bovine serum (FBS) (Gibco)ThermoFisher Scientific 10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC) ATCC, Manassas, VA, USA CRL-1642
L-Glutamine, USP  (Gibco)ThermoFisher Scientific 21051-024
Potassium chloride (KCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7447-40-7 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7778-77-0 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )
Sodium chloride (NaCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7647-14-5 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-10039-32-4 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )
Trypan Blue Sigma Aldrich T6146 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS
Trypsin Sigma Aldrich T4799 For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )
Zoletil 50 Virbac To dilute with 1X PBS 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420 KUBOTA Co. 2420
Culture dish (6cm) Wuxi NEST Biotechnology Co. 705001
Disposable syringe (with needle) Perfect Medical Industry Co. 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixer C.T.I YOUNG CHENN TS-20 For suspended cells recovery 
FACSCalibur (FACS) BD biosciences
Forceps Dimeda 10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc. HEPA CLASS 100
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) Stoelting 51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI Olympus FV1000MPE
Neubauer counting chamber Marienfeld-Superior 640010
Surgical scissor Dimeda 08.370.11
Surgical sutures  UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. NO. 0034 Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifuge tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001
15 mL Greiner tube Greiner bio-one 188271
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells – mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
  4. Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  5. Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
  6. Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
  7. Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  8. Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
  9. Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
  10. Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
  11. Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
  12. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
  13. van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
  14. Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
  15. Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
  16. von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
  17. Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
  18. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
  19. Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
  20. Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
  21. Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
  22. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
  23. Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
  24. Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
  25. Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
  26. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  27. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  28. Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
  29. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  30. Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
  31. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  32. Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
  33. Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
  34. Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
  35. Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
  36. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
  37. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  38. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  39. Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
  40. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  41. Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
  42. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  43. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  44. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  45. Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
  46. Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
  47. Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
  48. Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
  49. Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
  50. Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
  51. Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
  52. Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
  53. Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
  54. Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
  55. Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
  56. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  57. Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
  58. Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
  59. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  60. Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
  61. Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
  62. Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).

Tags

Keywords: Lung ColonizationCirculating Tumor CellsCancer MetastasisCell VisualizationCell CultureTrypsin-EDTACell SuspensionCentrifugationCFSETail Vein InjectionC57BL/6 Mouse
check_url/it/56761?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Lin, T., Liao, Y., Chang, W., Yang, C., Cheng, L., Cheng, M., Cheng, H. The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues. J. Vis. Exp. (136), e56761, doi:10.3791/56761 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image