Блот Assay количественных Dot для AAV титрования и его использования для функциональной оценки аденоассоциированный вирус Ассамблеи-активации белков
Summary
Эта рукопись подробности блот assay просто точка для количественный титры аденоассоциированный вирус (AAV) и ее применение для изучения роли Ассамблеи активации белков (ГПД), Роман класса неструктурных вирусных белков, обнаруженных в всех AAV серотипов, в деле содействия Ассамблее capsids, производные от родственных и гетерологичных AAV серотипов.
Abstract
Хотя аденоассоциированный вирус (AAV) широко признается как вектор привлекательным для генной терапии, она также служит вирус модель для понимания биологии вируса. В последнем случае недавнее открытие неструктурных AAV белка, называют Ассамблеи активация белка (AAP), пролили новый свет на процессы в Ассамблее вирусного капсида VP белков в капсида. Хотя многие AAV серотипов требуют AAP для Ассамблеи, мы недавно сообщили что AAV4, 5, 11, и исключения из этого правила. Кроме того мы показали, что ГПД и собрал capsids различных серотипов локализации для различных внутриклеточных отсеков. Этот неожиданный гетерогенность в биологических свойств и функциональной роли ГПД среди различных AAV серотипов подчеркивает важность исследований по ГПД, полученных от различных серотипов. Эта рукопись подробности блот assay просто точка для AAV количественный и ее применение для оценки AAP зависимостей и серотип специфичность в Ассамблее капсида. Чтобы продемонстрировать полезность этот assay блот точка, мы отправились в характеризуют капсид Ассамблеи и АПУ зависимость змея AAV, ранее uncharacterized рептилий AAV, а также AAV5 и AAV9, которые ранее было показано, быть AAP-независимые и зависимые от АПУ серотипов, соответственно. Assay показали, что змея AAV капсид Ассамблея требует AAP змея и не может поддерживаться ГПД от AAV5 и AAV9. Assay также показал, что, в отличие от многих общих Серотипа ГПД, способствующих гетерологичных капсид Ассамблеи по кросс комплементарности, змея АПУ не поощрять Ассамблея AAV9 capsids. Кроме того мы показываем, что выбор нуклеиназы значительно влияет на индикации пробирного блот точка, и таким образом, выбор оптимального фермента имеет решающее значение для успешной оценки AAV титры.
Introduction
Аденоассоциированный вирус (AAV) является небольшой, не охватило, одноцепочечной ДНК вируса с геном приблизительно 4,7 kilobases (КБ). AAV геном содержит фреймы (ORFs) открыть чтение для генов rep и Кап . В 2010 году ранее неизвестные неструктурных белков, кодируемых + 1 кадра смещается ORF внутри ген AAV2 колпачок был обнаружен Sonntag et al. и играть решающую роль в Ассамблее AAV2 капсид VP мономера белков в Вирусный Капсид1. Ассамблея активация белка (AAP) был назван этот роман белок той роли, которую она играет в содействии капсид Ассамблея1.
ORFs для АПУ были определены bioinformatically в геномах всех parvoviruses в рамках род Dependoparvovirus, но не геномов вирусов различных родов парвовирус семьи1,2. Функциональные исследования этого романа белка первоначально были сосредоточены на АПУ от прототипа AAV2 (AAP2), которая создала важную роль AAP2 в ориентации разобранном виде VP белки ядрышко для их накопления и формирования в полностью собрал capsids1,3,4. AAV2 capsids неспособность собрать в отсутствие AAP выражения был независимо подтверждены несколько групп, в том числе наш1,2,3,4,5 . Последующие исследования на AAV серотипы 1, 8 и 9 подтверждают решающую роль ГПД в Ассамблее капсида, как VP3 мономера белки AAV1, 8, и 9 были не в состоянии сформировать полностью собранный капсида в отсутствие совместного выражения AAP2.
Недавно, через подходов, которые включают в себя использование количественных точка помаркой анализов, мы исследовали способность AAV1 12 VP3 мономеров собрать в capsids в отсутствие экспрессии АПУ и способность AAP1 до 12 для содействия Ассамблее VP3 мономеров из гетерологичных серотипов. Это исследование показало, что AAV4, 5 и 11 VP3 мономеров могут собираться без АПУ. Кроме того, было установлено, что восемь из двенадцати ААР серотипов, мы рассмотрели (то есть, все, кроме AAP4, 5, 11 и 12) отображаются широкие возможности для поддержки капсид Ассамблеи гетерологичных AAV серотип capsids, а AAP4, 5, 11 и 12 отображается существенно ограниченные возможности в этой связи6. Эти четыре серотипов филогенетически далеких от других AAP серотипов2,3. Кроме того исследования обнаружили значительную гетерогенность в субцеллюлярные локализации различных ГПД6. Кроме того, исследование показало, что плотный ассоциации АПУ с собрал capsids и ядрышко, отличительной чертой AAV2 капсид Ассамблеи, обязательно не может распространяться на другие серотипы, включая AAV5, 8 и 9, которые отображают ядрышковые исключение собрал capsids6. Таким образом информация, полученная от изучения любого конкретного серотип АПУ не широко применимо для всех AAP биологии. Такие загадочные характер AAP биологии подчеркивает необходимость изучить роль и функции каждого АПУ от канонического и неканонических AAV серотипов.
Биологическая роль АПУ в Ассамблее капсид может оцениваться путем определения титры полностью упакованы AAV вирусных частиц производится в человеческих эмбриональных почек (ГЭС) 293 клетки, наиболее часто используемых клеточная линия для производства вектора AAV, с или без белка АПУ выражение. Стандартные методы для AAV количественный являются количественного PCR (ПЦР)-7,на основе анализов8 и количественные точка на основе блот assays9. Другие методы для AAV вирусных частиц количественный например иммуноферментного анализа10,11 или измерения оптической плотности12 не являются идеальными для образцов, полученных от многих различных серотипов AAV или образцов загрязненные примесей (сырой лизатов или культуры средств массовой информации), которые часто образцов, используемых для AAV исследований. В настоящее время ПЦР наиболее широко используется для AAV количественный; Однако это необходимо признать возможных предостережений на основе ПЦР анализа, как assay может привести к системной ошибки и титр значительные вариации13,14. На основе ПЦР анализов страдают от ряда потенциально привходящих факторов, таких как присутствия ковалентно закрытых терминала заколки в PCR шаблоны, которые тормозят амплификации13. Даже опытный человек может ввести потенциал отягощающих факторов на основе ПЦР анализа неосознанно13. В отличие от количественных точка анализов помаркой являются метод классической молекулярной биологии, который не включает амплификацию генома и использует гораздо проще принцип с минимальным риском ошибок по сравнению с на основе ПЦР анализов. Этот метод является менее технически сложной; Таким образом результаты анализа достаточно воспроизводимости даже неопытными лицами.
В настоящем докладе мы описываем методологические детали анализа помаркой количественной точки, мы обычно используем для вектора AAV количественный и являют собой пример, как применять пробу для изучения роли Ассамблеи содействие ГПД в общем серотипов (AAV5 и AAV9) и ранее uncharacterized АПУ от змея AAV14. В природе Аав VP белков и АПУ белки выражаются в СНГ от одного гена (то есть, VP-АПУ СНГ дополнения), а в assay, описанные здесь, вице-президент и АПУ белки поставляются в транс от двух отдельных плазмид (т.е., VP-АПУ Транс дополнения). Поскольку каждый VP или АПУ белка из различных серотипов может быть выражена от каждого независимого плазмида, становится возможным проверить гетерологичных VP-АПУ сочетания капсид сборки (то есть, VP-АПУ кросс дополнения). Кратко AAV VP3 из различных серотипов выражается в клетках ГЭС 293 плазмида ДНК трансфекции пакет генома вектора AAV в наличие или отсутствие родственных серотипа АПУ, или в присутствии гетерологичных серотип АПУ. После производства культуры средств массовой информации и lysates клетки подвергаются блот пробирного точка для количественного определения вирусного генома в оболочке капсида. Первый этап анализа помаркой точка является для лечения образцы с нуклеиназы удалить загрязняющие плазмида ДНК и неупакованных AAV геномов в образцах. Неспособность сделать это приведет к увеличению сигналов фона в частности когда assayed неочищенную образцы. Затем следуют протеазы лечения вирусных capsids и выпустить нуклеиназы стойкие вирусных геномов в образце решения. Далее, вирусных геномов денатурированный, смыл на мембрану и гибридизированных с зондом вирусной ДНК генома специфичные для количественный. В примере assay сообщили здесь мы показываем, что змея AAV VP3 требует змея AAP капсид Ассамблеи и что змея АПУ не содействовать Ассамблее AAV9 capsids в отличие от многих ГПД, производный от АПУ зависимых серотипов, которые могут также содействовать Ассамблее гетерологичных серотип capsids. Наконец мы сообщаем важное предостережение для ПЦР или точка на основе блот AAV количественный assays, что выбор нуклеиназы существенно влияет на результаты анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем докладе описан в полезности анализов помаркой количественных точка для изучения AAV ГПД и их роль в Ассамблее капсида. Знания, полученные от этих исследований может обеспечить подробное понимание врожденной различия в процессе AAV капсид Ассамблеи и функциональной роли ГПД м…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сяо Сяо в университете Северной Каролины в Чапел-Хилл за предоставление нам с pEMBL ЦМВ-GFP плазмиды. Мы благодарим Кристофер Чэн и Samuel J. Хуан для критических чтении рукописи. Эта работа была поддержана предоставляет служба общественного здравоохранения (низ R01 NS088399 и T32 EY232113).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
Riferimenti
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
- Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
- Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
- Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
- Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
- Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
- Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
- Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
- NEB, . 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , 302-368 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- . Bacterial Transformation Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017)
- . Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017)
- Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
- Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
- Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
- Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
- Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
- Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).
