Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas
Summary
Este manuscrito detalla un análisis de blot punto sencillo para la cuantificación de los títulos de virus adeno-asociado (AAV) y su aplicación para estudiar la función de activación de montaje proteínas (AAPs), una nueva clase de proteínas virales no estructurales en los AAV serotipos, en la promoción de la Asamblea de cápsida derivado de serotipos AAV cognados y heterólogos.
Abstract
Mientras que virus adeno-asociado (AAV) es ampliamente aceptado como un atractivo vector para terapia génica, también sirve como un virus modelo para entender la biología del virus. En este último sentido, el reciente descubrimiento de una proteína AAV no estructural, denominado proteína activadora de Asamblea (AAP), ha arrojado nueva luz sobre los procesos implicados en el ensamblaje de las proteínas de la cápside viral VP en una cápside. Aunque muchos serotipos AAV requieren AAP para la Asamblea, recientemente hemos reportado que AAV4, 5, y 11 son excepciones a esta regla. Además, demostramos que la AAPs y cápsida montado de diferentes serotipos localiza a diferentes compartimentos subcelulares. Este inesperada heterogeneidad en las propiedades biológicas y papeles funcional de Fiscalizacion entre AAV diferentes serotipos subraya que la importancia de los estudios sobre fiscalizacion derivada de diversos serotipos. Este manuscrito detalla un análisis de blot de punto sencillo para cuantificación de AAV y su aplicación para evaluar la especificidad de dependencia y serotipo AAP en el ensamblaje de la cápside. Para demostrar la utilidad de este análisis de dot blot, nos propusimos para caracterizar el conjunto de cápside y la dependencia de la AAP de AAV de la serpiente, un reptil previamente desacostumbrado AAV, así como AAV5 y AAV9, que previamente han demostrado ser independiente de la AAP y dependiente de la AAP serotipos, respectivamente. El análisis reveló que AAV serpiente cápside Asamblea requiere serpiente AAP y no puede ser promovido por Fiscalizacion de AAV5 y AAV9. El análisis también demostró que, a diferencia de muchos del serotipo común fiscalizacion que promover el montaje del cápside heteróloga por Cruz-complementación, serpiente AAP no promover el montaje de AAV9 cápsida. Además, nos muestran que la elección de nucleasa afecta significativamente la lectura de la prueba de dot blot, y así, elegir una enzima óptima es crítica para la exitosa evaluación de títulos AAV.
Introduction
Virus adeno-asociado (AAV) es un pequeño, no envuelto, monocatenario DNA virus con un genoma de aproximadamente 4,7 kilobases (kb). El genoma AAV contiene marcos de lectura abierta (ORFs) para los genes rep y cap . En 2010, una proteína no estructural previamente no identificada codificada por una ORF de marco-cambiado de puesto + 1 dentro del gene de la tapa de AAV2 fue descubierta por Sonntag et al. y encontrada para desempeñar un papel decisivo en el conjunto de proteínas del monómero de la VP de la cápsida de AAV2 en un viral de la cápside1. Esta nueva proteína nombre proteína activadora de Asamblea (AAP) el papel que desempeña en la promoción de cápside de montaje1.
Los ORFs para AAP han sido identificado bioinformatically en el genoma del parvovirus todos dentro del género Dependoparvovirus, pero no dentro de los genomas de los virus de diferentes géneros de la parvovirus familia1,2. Estudios funcionales de esta nueva proteína se centraron inicialmente en la AAP del prototipo AAV2 (AAP2), que ha establecido el papel esencial de AAP2 en contra completamente desmontadas proteínas VP al nucleolo para su acumulación y la formación en montado cápsida1,3,4. La incapacidad de la cápsida de AAV2 para montar en la ausencia de expresión de la AAP ha sido independientemente confirmada por varios grupos, incluido el nuestro1,2,3,4,5 . Estudios posteriores en los serotipos 1, 8 y 9 de AAV corroboraban el papel crítico de Fiscalizacion en la Asamblea de la cápsida, como proteínas de monómero de VP3 de AAV1, 8, y 9 eran incapaces de formar una cápside completamente montada en la ausencia de coexpresión de AAP2.
Recientemente, a través de enfoques que incluyen el uso de cuantitativo dot blot ensayos, investigamos la capacidad de AAV1 12 monómeros VP3 de montar en la cápsida en la ausencia de expresión de la AAP y la capacidad de la AAP1 12 de promover el montaje de VP3 monómeros de serotipos heterólogos. Este estudio ha revelado que AAV4, 5 y 11 VP3 monómeros pueden montar sin AAP. Además, se encontró que ocho de los doce serotipos AAP examinamos (es decir, todos menos AAP4, 5, 11 y 12) muestran una capacidad amplia para apoyar el conjunto de cápside de cápsida de serotipo heterólogo AAV, mientras AAP4, 5, 11 y 12 muestran un substancialmente capacidad limitada en este sentido6. Estos cuatro serotipos son filogenéticamente distantes de los AAP serotipos2,3. Por otra parte, el estudio ha descubierto una heterogeneidad significativa en localizaciones subcelulares de AAPs diferentes6. Además, el estudio ha sugerido que la asociación estrecha de AAP con cápsida montado y el nucleolo, el sello de la Asamblea de capsid AAV2, necesariamente no puede extenderse a otros serotipos incluyendo AAV5, 8 y 9, que mostrar la exclusión nucleolar de cápsida montado6. Así, la información obtenida del estudio de cualquier serotipo particular AAP no es ampliamente aplicable a la biología PAA todos. Tal naturaleza sorprendente de la biología de la AAP recalca la necesidad de investigar el papel y la función de cada PDA de serotipos AAV canónicos y no canónica.
La función biológica de la AAP en el ensamblaje de la cápside puede valorarse mediante la determinación de que los títulos de partícula viral AAV empaquetado completamente producción en riñón embrionario humano (HEK) 293 células, la línea celular más utilizados para la producción del vector AAV, con o sin proteína AAP expresión. Los métodos estándar para cuantificación de AAV son PCR cuantitativa (qPCR)-basado en ensayos7,8 y cuantitativa dot blot basado en ensayos de9. Otros métodos para la cuantificación de partículas virales AAV como densidad óptica medida12 de10,de análisis enzima-ligado del inmunosorbente11 no son ideales para muestras procedentes de muchos serotipos diferentes de AAV o muestras contaminados con impurezas (lisados crudos o medios de cultivo), que son a menudo las muestras utilizadas para la investigación AAV. En la actualidad, qPCR es más ampliamente utilizado para la cuantificación de la AAV; sin embargo, es necesario reconocer posibles advertencias de la prueba de la qPCR, como el ensayo pueden resultar en errores sistémicos y significativo título variaciones13,14. Ensayos de PCR son afectados por una serie de factores de confusión potencialmente factores como la presencia de horquillas terminales covalentemente cerrados en plantillas PCR que inhiben la amplificación13. Incluso un individuo experimentado puede presentar potencial de factores de confusión en qPCR-basado del análisis sin saberlo13. Por el contrario, cuantitativa dot blot ensayos son una técnica de biología molecular clásica que no implica la amplificación del genoma y utiliza un principio mucho más sencillo con un mínimo riesgo de errores en comparación con ensayos de qPCR. El método es menos técnicamente difícil; por lo tanto, los resultados del ensayo son razonablemente reproducibles incluso por personas sin experiencia.
En este informe, describimos los detalles metodológicos de un ensayo de blot dot cuantitativa utilizamos rutinariamente para cuantificación del vector AAV y proporcionar un ejemplo de cómo aplicar el análisis para estudiar el papel de promoción de la Asamblea de Fiscalizacion en común serotipos (AAV5 y AAV9) y un previamente desacostumbrada AAP de serpiente AAV14. En la naturaleza, proteínas VP de AAV y AAP proteínas se expresan en cis de un solo gen (es decir, VP-AAP cis-complementación), mientras que en el análisis aquí descrito, proteínas VP y AAP se suministran en el transporte de dos plásmidos separados (es decir, VP-AAP Trans-complementación). Puesto que cada proteína VP o AAP de diferentes serotipos puede expresarse de cada plásmido independiente, es posible probar combinaciones de VP-AAP heterólogas para el ensamblaje de la cápside (es decir, VP-AAP Cruz-complementación). Brevemente, AAV VP3 de varios serotipos se expresa en las células de HEK 293 por la transfección de DNA de plásmido para empaquetar un genoma del vector AAV en la presencia o ausencia del serotipo cognado AAP, o en presencia de un serotipo heterólogo AAP. Después de la producción, medios de cultivo y lysates de la célula son sometidos a un análisis de dot blot para cuantificar el genoma viral dentro de la cáscara de la cápside. El primer paso de la prueba de dot blot es tratar las muestras con una nucleasa para eliminar contaminantes plásmido DNAs y genoma AAV sin envasar en las muestras. No hacerlo aumentaría las señales de fondo en particular cuando se analizan muestras no purificadas. Esto es seguido por un tratamiento con proteasas para romper la cápsida viral y liberan genomas virales nucleasa resistente a soluciones de muestra. Genomas virales, siguiente son desnaturalizados, borrados en una membrana y cruzado por hibridación con una sonda de DNA específicos del genoma viral para la cuantificación. En el análisis del ejemplo divulgado aquí, demostramos que la serpiente AAV VP3 requiere serpiente AAP para el ensamblaje de la cápside y que serpiente AAP no promueve a la Asamblea de AAV9 cápsida a diferencia de muchos de los AAPs derivados de serotipos de AAP-dependiente que también pueden promover el montaje de cápsida de serotipo heterólogo. Por último, se reporta una importante ADVERTENCIA para qPCR o ensayos de cuantificación de AAV basado en blot dot que la elección de nucleasa afecta significativamente los resultados del ensayo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe se describe la utilidad de cuantitativa dot blot ensayos para estudiar AAPs de AAV y su papel en el ensamblaje de la cápside. Conocimiento obtenido de estos estudios puede proporcionar penetraciones detalladas en las diferencias innatas en el proceso de montaje de cápside AAV y el papel funcional de Fiscalizacion entre diferentes serotipos. En este sentido, el punto de Cruz-complementación de AAV VP3-AAP blot ensayo reveló que serpiente AAV VP3 muestra una dependencia estricta de la coexpresión de su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Xiao Xiao en la Universidad de North Carolina en Chapel Hill para facilitarnos el plásmido pEMBL-CMV-GFP. Agradecemos a Christopher Cheng y Samuel J. Huang para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de servicio de salud pública (NIH R01 NS088399 y T32 EY232113).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
Riferimenti
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