Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines
Summary
Ce manuscrit détaille un essai par transfert de point simple pour le dosage des titres adeno-associated virus (AAV) et son application pour étudier le rôle de l’Assemblée-activation protéines (AAPs), une nouvelle classe de protéines virales non structurales dans tous les AAV sérotypes, dans la promotion de l’Assemblée des capsides dérivé de sérotypes d’AAV apparentés et hétérologues.
Abstract
Bien qu’adeno-associated virus (AAV) est largement reconnue comme un vecteur attractif pour la thérapie génique, il sert aussi comme virus modèle pour comprendre la biologie du virus. Dans le respect de ce dernier, la récente découverte d’une protéine AAV non structurelles, appelée protéines activatrices Assemblée (PAA), a jeté une lumière nouvelle sur les processus impliqués dans l’assemblage des protéines de capside virale VP dans une capside. Bien que de nombreux sérotypes d’AAV exigent PAA pour l’assemblage, nous avons récemment rapporté que AAV4, 5, et 11 y a des exceptions à cette règle. En outre, nous avons démontré que AAPs et assemblés capsides des sérotypes différents localiser aux différents compartiments subcellulaires. Cette hétérogénéité inattendue dans les propriétés biologiques et de rôles fonctionnels de l’AAPs parmi différent AAV sérotypes souligne que l’importance des études sur AAPs provenant de divers sérotypes. Ce manuscrit détaille un simple dot blot de dosage pour dosage AAV et son application afin d’évaluer la spécificité de la dépendance et sérotype PAA dans l’assemblage de la capside. Pour démontrer l’utilité de ce test de la tache de dot, nous partîmes pour caractériser l’assemblage de la capside et dépendance PAA de serpent AAV, un reptile non définie auparavant AAV, ainsi que AAV5 et AAV9, qui ont déjà démontré qu’être PAA-indépendants et dépendants du PAA sérotypes, respectivement. L’analyse a révélé que Snake AAV capside Assemblée exige PAA de serpent et qu’il ne peut être promue par AAPs de AAV5 et AAV9. L’analyse a également montré que, contrairement à beaucoup du sérotype souvent AAPs qui favorisent l’assemblage de la capside hétérologue par Croix-complémentation, serpent PAA ne favorise pas l’Assemblée des capsides AAV9. En outre, nous montrons que le choix de la nucléase affecte de manière significative la lecture de l’essai de tache de dot, et ainsi, choisir une enzyme optimale est essentielle pour une évaluation réussie de titres d’AAV.
Introduction
Adeno-associated virus (AAV) est un virus à ADN petit, non enveloppés, simple brin avec un génome d’environ 4,7 kilobases (kb). Le génome de l’AAV contient des cadres de lecture ouvert (ORF) pour les gènes rep et cap . En 2010, une protéine non structuraux inconnue codée par un ORF décalés dans le cadre de + 1 gène de cap de l’AAV2 a été découvert par Sonntag et coll. et jugée jouent un rôle essentiel dans l’assemblage de AAV2 protéines de la capside VP monomère dans le viral 1de capside. Cette nouvelle protéine a été baptisée Assemblée-activating protein (PAA) le rôle qu’elle joue dans la promotion de capside Assemblée1.
L’ORFs PAA été bioinformatically identifié dans les génomes de tous les parvovirus dans le genre Dependoparvovirus, mais pas dans les génomes des virus de différents genres de la parvovirose famille1,2. Des études fonctionnelles de cette nouvelle protéine étaient initialement axées sur le PAA du prototype AAV2 (AAP2), qui a établi le rôle essentiel du AAP2 pour cibler les protéines VP démontées le nucléole pour leur accumulation et leur formation en entièrement assemblé des capsides1,3,4. L’incapacité des capsides AAV2 à assembler en l’absence d’expression de l’AAP a été indépendamment confirmé par plusieurs groupes, y compris la nôtre,1,2,3,4,5 . Des études ultérieures sur les sérotypes d’AAV 1, 8 et 9 corroborent le rôle crucial de l’AAPs dans Assemblée de capside, sous forme de protéines VP3 monomère de AAV1, 8, et 9 ont été incapables de former une capside entièrement Assemblée en l’absence de la co-expression de PAA2.
Récemment, grâce à des méthodes qui incluent l’utilisation quantitative dot blot essais, nous avons étudié la capacité des AAV1 à 12 VP3 monomères d’assembler dans des capsides en l’absence d’expression de la PAA et la capacité de AAP1 à 12 pour promouvoir l’Assemblée de VP3 monomères de sérotypes hétérologues. Cette étude a révélé que AAV4, 5 et 11 VP3 monomères peuvent se réunir sans PAA. En outre, il a été constaté que huit des douze sérotypes PAA nous avons examiné (c’est-à-diretous sauf AAP4, 5, 11 et 12) affiche une large capacité pour soutenir l’assemblage de la capside des capsides de sérotype AAV hétérologues, tout en AAP4, 5, 11 et 12 affiché un substantiellement capacité limitée à cet égard6. Ces quatre sérotypes sont phylogénétiquement éloignées des autres PAA sérotypes2,3. En outre, l’étude a révélé une hétérogénéité significative dans des localisations subcellulaires des différents AAPs6. En outre, l’étude a suggéré que l’association serrée PAA avec capsides assemblés et le nucléole, la marque distinctive d’AAV2 Assemblée de capside, ne peut nécessairement être étendue à d’autres sérotypes, y compris AAV5, 8 et 9, qui affichent des nucléole exclusion de capsides assemblé6. Ainsi, l’information obtenue grâce à l’étude d’un sérotype particulier PAA n’est pas applicable à tous les biologie du PAA. Telle nature curieux de biologie PAA souligne la nécessité d’enquêter sur le rôle et la fonction de chaque AAP de sérotypes d’AAV canoniques et non canoniques.
Le rôle biologique du PAA en assemblage de la capside peut être évalué en déterminant que les titres de particule virale AAV emballé entièrement produit en rein embryonnaire humain (HEK) 293 cellules, la lignée de cellules plus couramment utilisés pour la production de vecteur d’AAV, avec ou sans protéine PAA expression. Les méthodes standards pour le dosage de l’AAV sont PCR quantitative (qPCR)-dosages selon7,8 et quantitative dot blot-basé assays9. Autres méthodes de quantification des particules virales AAV comme enzyme-linked immunosorbent assay10,11 ou de mesure de densité optique12 ne sont pas idéales pour les échantillons provenant de nombreux différents sérotypes d’AAV ou échantillons contaminés par des impuretés (lysats bruts ou milieux de culture), qui sont souvent les échantillons utilisés pour la recherche de l’AAV. Actuellement, qPCR est plus largement utilisé pour le dosage de l’AAV ; Toutefois, il est nécessaire de reconnaître d’éventuels avertissements du dosage qPCR-basé, comme le dosage peuvent entraîner des erreurs systémiques et titre importantes variations13,14. Les analyses basées sur la PCR sont affectés par un certain nombre de facteurs, comme la présence de covalence fermés barettes terminales dans les modèles de PCR qui inhibent l’amplification13potentiellement confondants. Même une personne expérimentée peut introduire le potentiel des facteurs confondants dans une base de qPCR dosage inconsciemment13. En revanche, quantitative dot blot dosages sont une technique classique de biologie moléculaire qui ne comporte pas d’amplification du génome et utilise de manière beaucoup plus simple avec un risque minimal d’erreurs par rapport aux analyses qPCR. La méthode est moins techniquement difficile ; par conséquent, les résultats de titrage sont raisonnablement reproductibles même par des personnes inexpérimentées.
Dans ce rapport, nous décrivons les détails méthodologiques d’un test de la tache point quantitatif régulièrement, nous utilisons pour le dosage de vecteur AAV et fournissent un exemple de Comment veut appliquer l’analyse pour étudier le rôle de l’Assemblée-promotion du PAE en commun sérotypes (AAV5 et AAV9) et une auparavant non caractérisé PAA du serpent AAV14. Dans la nature, AAV VP protéines et protéines de l’AAP sont exprimés en cis d’un seul gène (c’est-à-dire, VP-PAA cis-complémentation), tandis que dans l’essai décrit ici, protéines VP et AAP sont fournis en trans de deux plasmides distincts (c.-à-d., VP-PAA TRANS-complémentation). Étant donné que chaque protéine VP ou PAA de sérotypes différents peut être exprimée de chaque plasmide indépendant, il devient possible de tester les combinaisons de VP-PAA hétérologues pour l’assemblage de la capside (c.-à-d., VP-PAA Croix-complémentation). Brièvement, AAV VP3 de différents sérotypes est exprimée dans les cellules HEK 293 par transfection d’ADN plasmidique pour empaqueter un génome de vecteur d’AAV en présence ou en absence du sérotype apparenté du PAA, ou en présence d’un sérotype hétérologue du PAA. Production, milieux de culture et de lysats cellulaires sont soumis à un essai de tache de dot pour quantifier le génome viral dans la coquille de la capside. La première étape du test dot blot est de traiter des échantillons avec une nucléase pour supprimer contaminantes plasmide DNAs et non emballés AAV génomes dans les échantillons. Faute de quoi augmenterait les signaux de fond en particulier lorsque des échantillons non-purifiés sont dosés. Ceci est alors suivi d’un traitement de protéase à briser les capsides virales et libérer des génomes viraux nucléase-résistante dans exemples de solutions. Prochaines, virales de génomes sont dénaturés, effacés sur une membrane et hybridés avec une sonde d’ADN spécifiques d’un génome virale à la quantification. Dans l’analyse de l’exemple rapporté ici, nous démontrons que Snake AAV VP3 exige PAA de serpent pour l’assemblage de la capside et que Snake PAA ne favorise pas l’Assemblée des capsides AAV9 contrairement à beaucoup de l’AAPs dérivée de sérotypes PAA-dépendante qui peuvent aussi favoriser l’Assemblée de capsides sérotype hétérologue. Enfin, nous présentons une mise en garde importante à qPCR ou quantification de VAA axée sur la tache point essais que le choix de la nucléase affecte significativement les résultats de titrage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce rapport, l’utilité des quantitatifs dot blot dosages pour étudier AAPs AAV et leur rôle dans l’assemblage de la capside est décrite. Connaissances acquises grâce à ces études peuvent fournir un aperçu détaillé les différences innées dans le processus de montage de capside AAV et le rôle fonctionnel de l’AAPs entre sérotypes différents. À cet égard, le point de croix-complémentation AAV VP3-PAA blot assay a révélé que Snake AAV VP3 affiche une dépendance stricte sur la co-expression de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Xiao Xiao à l’University of North Carolina at Chapel Hill nous remercions de nous avoir fourni le plasmide pEMBL-CMV-GFP. Nous remercions Christopher Cheng et Samuel J. Huang pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par Service de santé publique accorde (NIH R01 NS088399 et EY232113 T32).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
Riferimenti
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