Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine
Summary
Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für die Quantifizierung der Adeno-assoziierte Virus (AAV) Titer und deren Anwendung zur Untersuchung der Rolle von Montage-aktivierende Proteine (AAPs), eine neuartige Klasse von nichttragenden virale Proteine in allen AAV Serotypen, bei der Förderung der Versammlung des Capsids verwandt und heterologen AAV-Serotypen abgeleitet.
Abstract
Während Adeno-assoziierte Virus (AAV) als eine attraktive Vektor für die Gentherapie weithin anerkannt ist, dient es auch als Modell für das Verständnis der Biologie Virus Virus. In letzterer Hinsicht hat die jüngste Entdeckung eines nichtbauliche AAV-Proteins, Montage-aktivierende Protein (AAP), bezeichnet ein neues Licht auf die Vorgänge bei Einbau der viralen Kapsid VP Proteine in einem Kapsid vergossen. Obwohl viele AAV Serotypen AAP für die Montage benötigen, wir haben vor kurzem berichtet, dass AAV4, 5, und 11 sind Ausnahmen von dieser Regel. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass AAPs und montierten Capsids der verschiedenen Serotypen zu verschiedenen subzelluläre Kompartimente zu lokalisieren. Diese unerwartete Heterogenität in den biologischen Eigenschaften und Funktionsrollen der AAPs unter verschiedenen AAV Serotypen unterstreicht die Bedeutung der Studien über AAPs aus verschiedenen Serotypen abgeleitet. Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für AAV Quantifizierung und seine Anwendung auf AAP Abhängigkeit und Serotyp Spezifität in Kapsid Baugruppe zu beurteilen. Um das Dienstprogramm des Dot-Blot Assays zu demonstrieren, brachen wir um zu charakterisieren, Kapsid Montage- und AAP Abhängigkeit der Schlange AAV, ein zuvor fußgelenkes Reptil AAV, sowie AAV5 und AAV9, die bisher gezeigt wurden, AAP-unabhängige und AAP-abhängige Serotypen, beziehungsweise. Der Test ergab, dass die Schlange AAV Kapsid Montage erfordert Schlange AAP und kann nicht durch AAPs aus AAV5 und AAV9 gefördert werden. Der Test zeigte auch, dass im Gegensatz zu vielen gemeinsamen Serotyp AAPs, die Förderung der heterologen Kapsid Montage durch Kreuz-Ergänzung, Schlange AAP Versammlung des AAV9 Capsids nicht fördert. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Wahl der Nuklease erheblich das Auslesen des Dot-Blot Assays beeinträchtigt, und somit eine optimale Enzym Auswahl entscheidend für erfolgreiche Beurteilung der AAV-Titer ist.
Introduction
Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist ein kleines, unbehüllte, einzelsträngige DNA-Virus mit einem Genom von ca. 4,7 Kilobases (kb). Die AAV-Genom enthält offene Lesung Frames (ORFs) für die Rep und GAP Gene. Im Jahr 2010 wurde eine bislang nicht identifizierte Elementoptionen Protein kodiert, indem ein + 1 Rahmen verschoben ORF im AAV2 GAP gen von Sonntag Et Al. entdeckt und festgestellt, dass eine entscheidende Rolle bei der Montage des AAV2 Kapsid VP Monomer Proteine in einer viralen Kapsid1. Dieses neuartige Protein wurde Montage-aktivierende Protein (AAP) nach der Rolle benannt spielt es bei der Förderung von Kapsid Montage1.
ORFs für AAP schon identifizierten Bioinformatically in den Genomen von allen Parvoviren innerhalb der Gattung Dependoparvovirus, aber nicht in das Genom der Viren von verschiedenen Gattungen des Parvovirus Familie1,2. Funktionelle Studien dieses neuartigen Proteins konzentrierten sich zunächst auf der AAP vom Prototyp AAV2 (AAP2), die die wesentliche Rolle der AAP2 etabliert hat, bei der Ausrichtung unmontiert VP Proteine der Nukleolus für ihre Ansammlung und Bildung in vollem Umfang Capsids1,3,4montiert. Die Unfähigkeit der AAV2 Capsids zusammenzubauen in Ermangelung von AAP Ausdruck wurde unabhängig von mehreren Gruppen, einschließlich der unsrigen bestätigt1,2,3,4,5 . Nachfolgende Studien zur AAV Serotypen 1, 8 und 9 bestätigt die wichtige Rolle der AAPs im Kapsid Montage als VP3 Monomer Proteine AAV1, 8 und 9 waren nicht in der Lage, eine komplett montierte Kapsid bei fehlender Co Ausdruck von AAP2zu bilden.
Vor kurzem, durch Ansätze, die die Verwendung des quantitativen Dot blot Assays, untersuchten wir die Fähigkeit der AAV1, 12 VP3 Monomere zusammenzubauen in Capsids in der Abwesenheit von AAP Ausdruck und die Fähigkeit des AAP1 bis 12 Montage VP3 Monomere von zu fördern heterologen Serotypen. Diese Studie hat ergeben, dass AAV4, 5 und 11 VP3 Monomere können ohne AAP zusammenstellen. Darüber hinaus ergab, dass acht von zwölf AAP-Serotypen wir untersuchten (d.h.alle außer AAP4, 5, 11 und 12) angezeigt eine breite Fähigkeit, Kapsid Montage der heterologen AAV Serotyp Capsids, während AAP4, 5, 11 und 12 angezeigt unterstützen eine wesentlich begrenzten Möglichkeiten in dieser Hinsicht6. Diese vier Serotypen sind phylogenetisch weit entfernt von den anderen AAP Serotypen2,3. Darüber hinaus hat die Studie erhebliche Heterogenität in subzellulären Lokalisierungen von verschiedenen AAPs6aufgedeckt. Darüber hinaus die Studie hat vorgeschlagen, dass der enge Vereinigung von AAP mit montierten Capsids und Nukleolus, das Markenzeichen der AAV2 Kapsid Versammlung, nicht unbedingt zu anderen Serotypen, einschließlich AAV5, verlängert werden 8 und 9, die Nukleolus Ausschluss von anzeigen montierte Capsids6. Deshalb der Erkenntnissen aus der Studie bestimmten Serotyp AAP nicht breit anwendbar auf alle AAP Biologie. Solch rätselhafte Natur der AAP Biologie unterstreicht die Notwendigkeit, die Rolle und Funktion der einzelnen AAP von kanonischen und nicht-kanonischen AAV-Serotypen zu untersuchen.
Die biologische Rolle von AAP in Kapsid Baugruppe kann beurteilt werden, durch die Bestimmung, dass vollständig verpackt AAV Viruspartikel Titer in menschlichen embryonalen Niere (HEK) 293-Zellen, die am häufigsten verwendeten Zelllinie für AAV Vektor Produktion, mit oder ohne AAP Protein produziert Ausdruck. Die Standardmethoden für AAV Quantifizierung sind quantitative PCR (qPCR)-basierte Assays7,8 und quantitative Dot-Blot-basierte assays9. Andere Methoden zur AAV Viruspartikel Quantifizierung wie Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay10,11 oder optische Dichte Messung12 sind nicht ideal für Proben, die aus vielen verschiedenen AAV-Serotypen abgeleitet oder Proben mit Verunreinigungen (grobe Lysates oder Kultur, Medien), die oft für AAV Forschung verwendeten Proben kontaminiert. QPCR wird derzeit am häufigsten für AAV Quantifizierung verwendet; Allerdings ist es notwendig zu erkennen, mögliche Vorbehalte des qPCR basierende Assays, als der Test Systemfehler und bedeutende Titer Variationen13,14führen können. PCR-basierte Testsysteme betroffen sind eine Reihe von potenziell Störfaktoren, wie das Vorhandensein von kovalent geschlossenen terminal Haarnadeln in PCR-Vorlagen, die Verstärkung13hemmen. Sogar eine erfahrene Person Potenzial einführen kann Störfaktoren in einer qPCR-basierten Test unwissentlich13. Im Gegensatz dazu sind quantitative Dot-Blot Assays eine klassische Molekularbiologie-Technik, die beinhaltet keine Genom Verstärkung und verwendet ein viel einfacheres Prinzip mit einem minimalen Risiko von Fehlern im Vergleich zu qPCR basierende Assays. Die Methode ist weniger technisch anspruchsvoll; die Untersuchungsergebnisse sind daher auch von unerfahrenen Personen einigermaßen reproduzierbar.
In diesem Bericht beschreiben wir die methodischen Details eines quantitativen Dot Blot Assays wir routinemäßig für AAV Vektor Quantifizierung verwenden und geben Sie ein Beispiel von, wie den Test zur Untersuchung der Montage-Förderung der Rolle von AAPs gemeinsam anwenden Serotypen (AAV5 und AAV9) und eine zuvor fußgelenkes AAP von Snake AAV14. In der Natur AAV VP und AAP Proteine werden in der GUS von einem einzigen Gen (d.h., VP-AAP Cis-Ergänzung), während in der hier beschriebenen Test ausgedrückt, VP und AAP Proteine liefern wir in Trans aus zwei separaten Plasmide (d.h., VP-AAP Trans-Ergänzung). Da jede VP oder AAP Protein aus verschiedenen Serotypen von jeder unabhängige Plasmid ausgedrückt werden kann, wird es möglich, Heterologe VP-AAP-Kombinationen für Kapsid Assembly (d.h. VP-AAP Kreuz-Ergänzung) zu testen. Kurz, drückt AAV VP3 aus verschiedenen Serotypen in HEK 293 Zellen von Plasmid DNA Transfektion, ein AAV-Vektor-Genom in das Vorhandensein oder Fehlen des cognate Serotyps AAP oder in Anwesenheit einer heterologen Serotyp AAP zu verpacken. Nach der Produktion unterliegen Nährmedien und Zelle Lysates ein Dot Blot Assay, das virale Genom innerhalb der Kapsid Shell zu quantifizieren. Der erste Schritt des Dot-Blot Assays ist zur Behandlung von Proben mit einer Nuklease kontaminierenden Plasmid-DNA und unverpackten AAV Genome in Proben zu entfernen. Andernfalls würde die Hintergrund-Signale insbesondere erhöhen, wenn ungereinigten Proben analysiert werden. Darauf folgt dann durch eine Protease-Behandlung zu brechen viralen Capsids und Nuklease-resistente viraler Genome in Beispiellösungen freisetzen. Nächste, virale Genome sind denaturiert, getupft auf eine Membran und hybridisiert mit eine virale Genom-spezifische DNA-Sonde für die Quantifizierung. In der Beispiel-Test hier berichtet zeigen wir Ihnen, dass Snake AAV VP3 Schlange AAP Kapsid Montage und Schlange AAP fördert nicht die Montage des AAV9 Capsids im Gegensatz zu vielen der AAPs abgeleitet von AAP-abhängige Serotypen, die auch die Montage von fördern können Heterologe Serotyp Capsids. Zu guter Letzt berichten wir eine wichtige Einschränkung, qPCR oder Dot-Blot-basierte AAV Quantifizierung Tests, dass die Wahl der Nuklease die Untersuchungsergebnisse erheblich beeinträchtigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht wird die Nützlichkeit des quantitativen Dot-Blot Assays AAV AAPs und ihre Rolle im Kapsid Montage studieren beschrieben. Erkenntnisse aus diesen Studien bieten detaillierte Einblicke in die angeborenen Unterschiede in den Prozess der AAV Kapsid Montage und die funktionale Rolle der AAPs zwischen verschiedenen Serotypen. In dieser Hinsicht der AAV VP3-AAP Kreuz-Ergänzung Dot blot Test ergab, dass die Schlange AAV VP3 eine strenge Abhängigkeit auf die Co Expression von seinen Verwandten AAP Kapsid Mont…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die Bereitstellung von uns mit dem pEMBL-CMV-GFP-Plasmid Xiao Xiao an der University of North Carolina in Chapel Hill. Wir danken Christopher Cheng und Samuel J. Huang für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service (NIH R01 NS088399 und T32 EY232113) gewährt.
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
Riferimenti
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
- Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
- Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
- Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
- Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
- Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
- Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
- Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
- NEB, . 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , 302-368 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- . Bacterial Transformation Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017)
- . Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017)
- Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
- Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
- Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
- Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
- Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
- Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).
