וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים
Summary
כתב יד זה פרטים של assay חשופה נקודה פשוטה עבור כימות של adeno-הקשורים וירוס (AAV) titers ויישומו ללמוד את התפקיד של הפעלת מכלול חלבונים (AAPs), שיעור הרומן של חלבונים נגיפיים שאינן מבניות נמצאו AAV כל אשר נגרמו מהזנים אליהם, בקידום ההרכבה של capsids נגזר cognate, heterologous AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם.
Abstract
בעוד adeno-הקשורים וירוס (AAV) מקובל כמו וקטור אטרקטיבי עבור טיפול גנטי, הוא משמש גם כמו וירוס מודל להבנת הביולוגיה וירוס. ב- הכבוד האחרון, התגלית האחרונה של חלבון AAV שאינן מבניות, כינה הרכבה-הפעלת חלבון (AAP), יש שופכים אור חדש על התהליכים המעורבים הרכבה של החלבונים capsid ויראלי סמנכ לתוך capsid. אמנם רבים AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם דרושה AAP להרכבה, לאחרונה דיווחנו כי AAV4, 5, 11 הם היוצאים מן הכלל. יתר על כן, אנחנו הראו כי AAPs, שהורכב capsids של אשר נגרמו מהזנים אליהם שונה בתרגום כדי תאים subcellular שונים. זה הטרוגניות בלתי צפויה של תכונות ביולוגיות ותפקידים פונקציונלי של AAPs בין AAV שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם מקפים תחתונים שהחשיבות של מחקרים על AAPs נגזר מגוונות אשר נגרמו מהזנים אליהם. כתב יד זה מפרט assay כתם של נקודה פשוטה עבור כימות AAV ויישומו להעריך AAP תלות, serotype ירידה לפרטים capsid ההרכבה. כדי להדגים את התועלת של assay חשופה זו נקודה, יצאנו לאפיין capsid הרכבה ותלות AAP AAV הנחש זוחל בעבר uncharacterized AAV, כמו גם AAV5, AAV9, אשר בעבר הוכחו להיות AAP-עצמאי, תלוי-AAP אשר נגרמו מהזנים אליהם, בהתאמה. וזמינותו חשף כי הנחש AAV capsid הרכבה דורש AAP הנחש, לא יקודם על ידי AAPs מ AAV5 ו AAV9. וזמינותו הראה גם כי, שלא כמו רבים serotype נפוצות AAPs המקדמים הרכבה heterologous capsid על ידי הצלב-קומפלמנטציה, הנחש AAP אינו מקדם הרכבה של AAV9 capsids. בנוסף, אנו מראים כי הבחירה של נוקלאז משפיע באופן משמעותי את המדידה של נקודה חשופה וזמינותו, לפיכך, בחירת אנזים אופטימלית היא קריטית להערכת מוצלחת של AAV titers.
Introduction
וירוס Adeno-הקשורים (AAV) הוא וירוס קטן, שאינו אפוף, חד-גדילי DNA עם הגנום של 4.7 kilobases (kb). הגנום AAV מכיל מסגרות הקריאה הפתוחה (ORFs) על הגנים נציג , קאפ . בשנת 2010, חלבון nonstructural מזוהה בעבר מקודד על ידי ORF מסגרת-העביר +1 בתוך הגן קאפ AAV2 היה התגלה על ידי סונטג. et al. ומצא כדי לשחק תפקיד קריטי האסיפה החלבונים מונומר capsid סמנכ ל AAV2 לתוך נגיפי capsid1. חלבון זה הרומן נקראה האסיפה-הפעלת חלבון (AAP) התפקיד שהיא ממלאת בקידום capsid הרכבה1.
ORFs עבור AAP כבר מזוהה bioinformatically בתוך הגנום של כל parvoviruses הסוג של Dependoparvovirus, אך לא בתוך הגנום של וירוסים של סוגים שונים של הפרוו משפחה1,2. מחקרים פונקציונלי של חלבון זה הרומן התמקדו בתחילה AAP מן הטיפוס AAV2 (AAP2), אשר הקימה את התפקיד החיוני של AAP2 המיקוד חלבונים סמנכ ל unassembled גרעינון הצטברות, היווצרות לתוך באופן מלא התאספו3,1,capsids4. חוסר היכולת של capsids AAV2 להרכיב, בהעדר ביטוי AAP היה עצמאי מאושרות על ידי מספר קבוצות, כולל שלנו1,2,3,4,5 . מחקרים מאוחרים יותר על AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם 1, 8 ו- 9 לאשר את תפקיד מכריע של AAPs capsid הרכבה, כמו VP3 חלבונים מונומר של AAV1, 8, 9 היו מסוגלים ליצור של capsid שהרכבתם בהעדר ביטוי משותף של AAP2.
לאחרונה, דרך גישות הכוללות שימוש נקודה כמותיים כתם מבחני, חקרנו את היכולת של AAV1 12 VP3 מונומרים להרכיב לתוך capsids העדר ביטוי AAP ואת היכולת של AAP1 ל- 12 כדי לקדם את הרכבה של מונומרים VP3 מ heterologous אשר נגרמו מהזנים אליהם. מחקר זה גילה את AAV4, VP3 5, ו 11 מונומרים יכולים להרכיב ללא AAP. בנוסף, זה היה נמצא כי 8 מתוך שנים עשר AAP אשר נגרמו מהזנים אליהם שבדקנו (קרי, כולם חוץ AAP4, 5, 11, 12) מוצג בעל יכולת רחבה כדי לתמוך capsid הרכבה של heterologous capsids serotype AAV, בעוד AAP4, 5, 11 ו- 12 מוצגים באופן משמעותי יכולת מוגבלת בזה כבוד6. אלה ארבע אשר נגרמו מהזנים אליהם נמצאים רחוק phylogenetically אחרים AAP אשר נגרמו מהזנים אליהם2,3. יתר על כן, המחקר חשף הטרוגניות משמעותי בהגרסא המקומית subcellular של AAPs שונים6. יתר על כן, המחקר הראו כי איגוד חזק AAP ועם שהורכב capsids גרעינון, סימן ההיכר של AAV2 capsid הרכבה, לא בהכרח ניתן להרחיב אחרים אשר נגרמו מהזנים אליהם כולל AAV5, 8, 9, המציגים החרגת nucleolar שהורכב capsids6. לכן, המידע שנרכש מתוך המחקר של כל serotype מסוים AAP אינה ישימה בהרחבה כל AAP לביולוגיה. הטבע תמוה כזה לביולוגיה AAP מדגיש את הצורך לחקור את תפקיד והתפקוד של כל AAP מ הקנוני והן קאנונית AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם.
התפקיד הביולוגי של AAP בהרכבה capsid יכול להיות מוערך על ידי קביעת שארוז מלא AAV נגיפי חלקיקים titers המיוצר כליה עובריים אנושיים (HEK) 293 תאים, הקו הסלולרי הנפוץ ביותר לייצור וקטור AAV, עם או בלי חלבון AAP ביטוי. השיטות הסטנדרטיות עבור כימות AAV הם ה-PCR כמותי (qPCR)-מבחני מבחני מבוסס7,8 ו- dot כמותי המבוסס על כתם9. שיטות נוספות AAV כימות חלקיק נגיפי כמו מקושרים-אנזים immunosorbent assay10,11 או מדידת צפיפות אופטית12 אינם אידיאליים עבור דוגמאות נגזר אשר נגרמו מהזנים רבים אליהם שונה AAV או דגימות מזוהם עם זיהומים (lysates גולמי או תרבות המדיה), לעתים קרובות הדגימות שימשו AAV מחקר. כיום, qPCR נמצא בשימוש נרחב ביותר עבור כימות AAV; עם זאת, הצורך להכיר פוטנציאליים אזהרות של וזמינותו מבוססי qPCR, כמו וזמינותו יכול לגרום כייל משמעותי הווריאציות13,14ושגיאות מערכתית. מבחני מבוססי ה-PCR מושפעים על ידי מספר פוטנציאלי משתנה מתערב גורמים, כגון הנוכחות של covalently סגורה מסוף סיכות בתבניות PCR המעכבות הגברה13. אפילו אדם מנוסה יכול להציג את הפוטנציאל גורמים מבלבלים לתוך מבוסס-qPCR assay ביודעין13. לעומת זאת, מבחני חשופה נקודה כמותית הם טכניקה קלאסית ביולוגיה מולקולרית אינו כרוך הגנום הגברה ומשתמש עיקרון פשוט עם סיכון מינימלי של שגיאות לעומת מבחני מבוסס qPCR. השיטה זו פחות מבחינה טכנית מאתגר; לכן, התוצאות assay הן לשחזור באופן סביר אפילו על ידי אנשים חסרי ניסיון.
בדו ח זה, אנו מתארים את הפרטים מתודולוגי של נקודה כמותיים חשופה assay באופן שגרתי להשתמש עבור כימות וקטור AAV ואנו מספקים דוגמא של איך ליישם את הבדיקה כדי ללמוד את תפקיד קידום מכלול AAPs במשותף אשר נגרמו מהזנים אליהם (AAV5 ו- AAV9), בעבר uncharacterized AAP מן הנחש AAV14. בטבע, סמנכ ל AAV חלבונים וחלבונים AAP מבוטאים חבר העמים של גן יחיד (קרי, סמנכ ל- AAP cis-קומפלמנטציה), ואילו בוזמינותו המתוארים כאן, סמנכ ל ו- AAP חלבונים מסופקים טרנס מ בשני פלסמידים נפרדות (כלומר, סמנכ ל- AAP טרנס-קומפלמנטציה). מאז ניתן לבטא כל חלבון סמנכ ל או AAP מ אשר נגרמו מהזנים אליהם שונה מן כל פלסמיד עצמאית, הוא הופך אפשרי לבדוק heterologous שילובים סמנכ ל- AAP להרכבה capsid (קרי, סמנכ ל- AAP קרוס-קומפלמנטציה). בקצרה, AAV VP3 מ שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם מתבטא בתאים HEK 293 מאת פלסמיד תקנים דנ א כדי לארוז של הגנום וקטור AAV ב נוכחות או היעדרות של serotype cognate של AAP, או בנוכחות של serotype heterologous AAP. בעקבות הפקה, תקשורת תרבות, lysates תא נידונים assay כתם נקודה לכמת את הגנום הנגיפי בתוך הקליפה capsid. השלב הראשון של וזמינותו חשופה נקודה הוא להתייחס דגימות עם נוקלאז להסיר מזהמים פלסמיד DNAs ואת הגנום AAV unpackaged בדגימות. כך להגדיל את האותות רקע בפרט כאשר דגימות ולזרימה הם לבדיקה. זה ואז ואחריו טיפול פרוטאז כדי לשבור את capsids ויראלי ונשחרר הגנום הנגיפי עמידים נוקלאז פתרונות לדוגמה. הגנום הבא, נגיפי שפגע בסימני, מחק על קרום, hybridized גשש DNA ספציפיים גנום ויראלי עבור כימות. ב וזמינותו דוגמה דיווחו כאן, נדגים כי הנחש AAV VP3 דורש הנחש AAP להרכבה capsid ולקדם כי הנחש AAP לא ההרכבה של AAV9 capsids בניגוד רבים AAPs נגזר אשר נגרמו מהזנים אליהם תלויי-AAP יכולה לקדם גם הרכבה של heterologous serotype capsids. לבסוף, אנחנו מדווחים על הקונה חשוב qPCR או נקודה מבוססי חשופה AAV כימות assays כי הבחירה של נוקלאז משפיעה באופן משמעותי על תוצאות וזמינותו.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדו ח זה, מתואר השירות של נקודה כמותיים מבחני חשופה ללמוד AAV AAPs ותפקידם capsid הרכבה. הידע שנרכש ממחקרים אלה יכולים לספק תובנות מפורט ההבדלים מולדת בתהליך AAV capsid הרכבה ותפקידה פונקציונלי של AAPs בין שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם. במובן זה, הנקודה קרוס-קומפלמנטציה AAV VP3-AAP כתם assay חשף כי הנחש AAV VP3 המו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים שיאו שיאו-מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ’אפל היל סיפק לנו פלסמיד pEMBL-CMV-GFP. אנו מודים כריסטופר נג ווונג ג שמואל על קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי שירותי הבריאות הציבוריים מעניק (NIH R01 NS088399 ו- T32 EY232113).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
Riferimenti
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
- Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
- Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
- Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
- Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
- Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
- Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
- Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
- NEB, . 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , 302-368 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- . Bacterial Transformation Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017)
- . Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017)
- Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
- Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
- Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
- Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
- Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
- Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).
