Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler
Summary
Bu el yazması bir basit nokta leke tahlil Nefelometri adeno ilişkili virüs (AAV) titreleri ve derleme aktif rol çalışmaya uygulanması için detayları proteinleri (AAPs), yapısal olmayan viral proteinlerin tüm AAV buldu romanı bir sınıf serotipleri, soydaş ve kapaklı AAV serotipleri türetilmiş capsids Meclisi teşvik.
Abstract
Adeno ilişkili virüs (AAV) yaygın olarak gen tedavisi için çekici bir vektör olarak kabul ederken, ayrıca virüs biyoloji anlamak için bir model virüs olarak hizmet vermektedir. İkinci açıdan derleme aktive protein (AAP) olarak adlandırdığı bir yapısal olmayan AAV protein son keşfi viral kapsid VP proteinlerin derlemeye bir kapsid içinde gerçekleştirilen işlemlere yeni bir ışık tutmuştur. Birçok AAV serotipleri için derleme AAP gerektirse de, son zamanlarda bildirdin bu AAV4, 5, ve 11 Bu kuralın istisnaları vardır. Ayrıca, AAPs ve monte capsids farklı serotipleri için farklı hücre altı bölmeleri yerelleştirmek gösterdi. Biyolojik özellikleri ve AAPs arasında farklı AAV, fonksiyonel rollerinin beklenmeyen bu heterojenlik önemini AAPs üzerine farklı serotipleri türetilen alt çizgi serotipleri. Bu el yazması bir basit nokta leke tahlil AAV Nefelometri ve kapsid derlemesinde AAP bağımlılık ve serotip özgüllük değerlendirmek için uygulama için ayrıntıları. Bu dot blot testin yardımcı programı göstermek için biz kapsid derleme ve AAP bağımlılık yılan AAV, daha önce uncharacterized sürüngen AAV, hem de AAV5 ve AAV9, hangi AAP bağımsız ve AAP bağımlı olmak daha önce gösterilmiş olan karakterize etmek için yola çıktı , sırasıyla serotipleri. Tahlil ortaya yılan AAV kapsid derleme yılan AAP gerektirir ve AAPs tarafından AAV5 ve AAV9 yükseltilemez. Tahlil birçok ortak serotip Contegra kapsid derleme çapraz-uluslara tarafından teşvik AAPs, yılan AAP AAV9 capsids Meclisi teşvik değil, aynı zamanda gösterdi. Buna ek olarak, biz seçimi nükleaz, önemli ölçüde dot blot testin okuma etkiler ve böylece, en uygun bir enzim seçme AAV titreleri başarılı değerlendirmesi için kritik olduğunu gösteriyor.
Introduction
Adeno ilişkili virüs (AAV) genomu yaklaşık 4.7 kilobases (kb) ile küçük, Sigara saran, tek iplikçikli DNA virüsüdür. AAV genom açık okuma çerçevesi (ORFs) temsilcisi ile kap gen için içerir. 2010’da evvelce tanımlanamayan bir mekansal protein + 1 çerçeve kaymıştır ORF AAV2 kap gen içinde tarafından kodlanmış Sonntag vd tarafından keşfedilen ve AAV2 kapsid VP monomer proteinler bütünleştirilmiş koda bir viral kritik bir rol oynamak için bulundu kapsid1. Bu roman protein derleme aktive protein (AAP) kapsid derleme1teşvik oynadığı rolü sonra adlandırılmıştır.
AAP için ORFs tüm parvoviruses cins Dependoparvovirusiçinde ancak farklı cins parvovirus aile1,2virüs genleri içinde genleri tespit bioinformatically olmuştur. Bu roman protein fonksiyonel çalışmalar başlangıçta hangi AAP2 önemli rol unassembled VP proteinleri birikimi ve düzene çekirdekçik için tam hedefleme kurmuştur AAP AAV2 prototipten (AAP2), üzerinde durulmuştur capsids1,3,4toplandı. AAP ifade olmaması durumunda montajı AAV2 capsids yetersizliği bağımsız oldu bizimki de dahil olmak üzere birden çok grubu tarafından1,2,3,4,5 onaylandıktan . AAV serotipleri 1, 8 ve 9 sonraki çalışmalar AAPs kritik rolü ile kapsid derleme, AAV1, 8, VP3 monomer proteinler olarak doğrulanmıştır ve 9 tam olarak birleştirilmiş bir kapsid AAP2Co ifade yokluğunda oluşturmak yapamaz.
Son zamanlarda, nicel nokta kullanımını içeren yaklaşımlar deneyleri leke, biz AAV1 yeteneği VP3 monomerleri Meclisi tanıtmak için 12 AAP ifade yokluğu ve AAP1 yeteneği capsids içine monte 12 VP3 monomer için araştırdık kapaklı serotipleri. Bu çalışmada ortaya koyduğu bu AAV4, 5 ve 11 VP3 monomerleri AAP monte. Ayrıca, biz muayene on iki AAP serotipleri sekizi bulundu oldu (yani, tüm AAP4, ama 5, 11 ve 12) AAP4, 5, 11 ve 12 görüntülenen süre Contegra AAV serotip capsids Meclisi kapsid desteklemek için geniş bir yetenek görüntülenen bir önemli ölçüde Bu konuda6sınırlı yetenek. Bu dört serotipi diğer AAP serotipleri2,3filogenetik uzak. Ayrıca, çalışma içinde farklı AAPs6hücre altı yerelleştirmeler önemli heterojenite ortaya çıkardı. Ayrıca, çalışma AAP sıkı Derneği ile birleştirilmiş capsids ve çekirdekçik, AAV2 kapsid derleme, hallmark mutlaka AAV5, dahil olmak üzere diğer serotipleri genişletilemez önerdi 8 ve 9, genelde dışlanması görüntülemek Monte capsids6. Böylece, herhangi bir belirli serotip AAP çalışma elde edilen bilgilerden tüm AAP biyoloji için genel olarak geçerli değildir. Böyle şaşırtıcı doğa AAP biyoloji rolü ve fonksiyonu her AAP kurallı ve kanonik olmayan AAV serotipleri üzerinden araştırmak gereğini vurgular.
Biyolojik rolü AAP kapsid derleme tam olarak paketlenmiş AAV viral parçacık titreleri insan embriyonik böbrek (HEK) 293 hücreleri, en sık kullanılan hücre kültürünü AAV vektör üretim, ile ya da ezelî AAP protein için üretilen belirleyerek tespit edilebilir ifade. Kantitatif PCR (qPCR) AAV Nefelometri için standart metodlar-tabanlı deneyleri7,8 ve nicel nokta leke tabanlı deneyleri9. Diğer yöntemleri için AAV viral parçacık Nefelometri enzim bağlı immunosorbent assay10,11 veya optik yoğunluk ölçüm12 gibi birçok farklı AAV serotipleri elde edilen örnekler veya örnekleri için ideal değildir sık sık AAV araştırmalar için kullanılan örnekleri kirleri (ham lysates veya kültür ortamı), ile kirlenmiş. Şu anda, qPCR en yaygın AAV Nefelometri için kullanılır; Ancak, potansiyel uyarılar qPCR tabanlı testin tahlil olarak sistemik hataları ve önemli titresi varyasyonları13,14neden olabilir kabul etmek gereklidir. PCR tabanlı deneyleri potansiyel kovalent kapalı terminal saç tokaları amplifikasyon13inhibe PCR şablonları varlığı gibi faktörler semptomlarıdır bir dizi etkilenir. Deneyimli bir birey bile potansiyel tanıtabilirsiniz karıştırıcı faktörlerin qPCR tabanlı içine tahlil bilmeden13. Buna ek olarak, nicel nokta leke deneyleri genom amplifikasyon içermeyen ve hataları qPCR tabanlı deneyleri ile karşılaştırıldığında en az riskle çok daha basit ilke kullanan bir klasik moleküler biyoloji tekniği vardır. Teknik olarak zor daha az yöntemdir; Bu nedenle, tahlil sonuçları bile deneyimsiz kişiler tarafından makul tekrarlanabilir.
Bu raporda, biz biz düzenli olarak AAV vektör Nefelometri için kullanın ve nasıl AAPs derleme teşvik rolü ortak çalışmaya tahlil uygulamak için (AAV5 ve AAV9) serotipleri ve bir örnek sağlar bir nicel nokta leke tahlil metodolojik ayrıntıları açıklamak daha önce uncharacterized AAP yılan AAV14. Doğada, AAV VP proteinler ve AAP proteinler CIS bir tek gen (yani, VP-AAP CIS-tamamlayıcı), burada açıklanan tahlil üzerinden ifade edilir, Müdür Yardımcısı ve AAP proteinler trans iki ayrı plazmid (yani, VP-AAP üzerinden sağlanır Trans-tamamlayıcı). Farklı serotipleri her VP veya AAP protein her bağımsız plazmid ifade edilebilir beri kapsid derleme (yani, VP-AAP çapraz-tamamlayıcı) için kapaklı VP-AAP kombinasyonları test etmek mümkün olur. Kısaca, çeşitli serotipleri üzerinden AAV VP3 HEK 293 hücrelerinde varlığı veya yokluğu soydaş serotip AAP veya kapaklı serotip AAP huzurunda bir AAV vektör genom paketlemek için plazmid DNA transfection tarafından ifade edilir. Üretim, Kültür Medya ve hücre lysates kapsid kabuk içinde viral genom ölçmek için bir nokta leke tahlil için tabi tutulmaktadır. Dot blot testin ilk adım örnekler bulaşıcı plazmid DNA’lar ve ambalajsız AAV genleri örneklerinde kaldırmak için bir nükleaz ile tedavi etmektir. Aksi halde ne zaman unpurified örnekleri denetlesinler arka plan sinyalleri özellikle artış olacaktır. Bu da bir proteaz tedavi viral capsids kırmak ve örnek çözümlerinizle nükleaz dayanıklı viral genom yayın tarafından takip ediyor. Sonraki, viral genom bir membran üzerinde deyimiyle, denatüre ve Nefelometri bir viral genom özgü DNA prob ile melezleşmiştir. Rapor burada örnek tahlil biz yılan AAV VP3 kapsid derleme için yılan AAP gerektirir ve yılan AAP AAV9 capsids Ayrıca Meclisi yükseltebilirsiniz AAP bağımlı serotipleri türetilmiş AAPs çoğunu aksine Meclisi teşvik değil göstermek kapaklı serotip capsids. Son olarak, biz qPCR için önemli bir uyarı raporu veya seçimi nükleaz, önemli ölçüde tahlil sonuçları etkiler nokta leke tabanlı AAV Nefelometri deneyleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, nicel nokta leke deneyleri AAV AAPs ve kapsid derleme içindeki rollerine çalışmaya yardımcı programı açıklanır. Bu çalışmalardan elde bilgi AAPs işlevsel rolü farklı serotipleri arasında ve doğuştan gelen farklar AAV kapsid montaj sürecinde ayrıntılı kazandırabileceğini. Bu bağlamda AAV VP3-AAP çapraz-uluslara nokta leke yılan AAV VP3 soydaş, AAP kapsid derleme için ortak ifade sıkı bir bağımlılık görüntülenen ve yılan AAP Contegra serotipleri kapsid Meclisi teşvik de?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Xiao Xiao Kuzey Carolina Üniversitesi, Chapel Hill pEMBL-CMV-GFP plazmid ile bize verdiğiniz için teşekkür ederiz. Christopher Cheng ve Samuel J. Huang el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu eser tarafından desteklenmiştir (NIH R01 NS088399 ve T32 EY232113) halk sağlığı hizmeti verir.
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
Riferimenti
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
- Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
- Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
- Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
- Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
- Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
- Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
- Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
- NEB, . 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , 302-368 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- . Bacterial Transformation Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017)
- . Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017)
- Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
- Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
- Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
- Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
- Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
- Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).
