Een kwantitatieve Dot Blot Assay voor AAV titratie en het gebruik ervan voor functionele beoordeling van het Adeno-associated Virus Assembly-activeren eiwitten
Summary
Dit manuscript details een eenvoudig punt vlek assay voor kwantificatie van adeno-associated virus (AAV) titers en de toepassing ervan op het bestuderen van de rol van de vergadering-activeren eiwitten (AAPs), een nieuwe klasse van niet-structurele virale eiwitten gevonden in alle AAV serotypen, bij het bevorderen van de vergadering van capsids afgeleid van cognaat en heterologe AAV serotypen.
Abstract
Terwijl adeno-associated virus (AAV) algemeen aanvaard wordt als een aantrekkelijke vector voor gentherapie, dient het ook als een virus model voor het begrip van de biologie van het virus. De laatste betreft, heeft de recente ontdekking van een niet-structurele AAV eiwit, genoemd vergadering-activeren eiwit (AAP), werpen nieuw licht op de processen die betrokken zijn bij de vergadering van de virale Eiwitmantel VP-eiwitten in een Eiwitmantel. Hoewel veel AAV serotypen AAP voor montage vereist, hebben we onlangs gemeld dat AAV4, 5 en 11 zijn uitzonderingen op deze regel. Bovendien, we laten zien dat AAPs en geassembleerde capsids van verschillende serotypes naar verschillende subcellular compartimenten lokaliseren. Deze onverwachte heterogeniteit in de biologische eigenschappen en functionele rollen van AAPs onder verschillende AAV serotypen onderstreept die het belang van studies over AAPs afgeleid van verschillende serotypen. Dit manuscript detailleert een eenvoudig punt vlek assay voor AAV kwantificatie en de toepassing ervan te beoordelen AAP afhankelijkheid en serotype specificiteit in Eiwitmantel vergadering. Om aan te tonen het nut van deze dot vlek assay, uiteengezet we te karakteriseren Eiwitmantel vergadering en AAP afhankelijkheid van Snake AAV, een eerder genfunctieonderzoek reptiel AAV, evenals AAV5 en AAV9, die eerder is aangetoond dat het onafhankelijk is van AAP en AAP-afhankelijke serotypen, respectievelijk. De test bleek dat Snake AAV Eiwitmantel vergadering Snake AAP vereist en kan niet worden bevorderd door AAPs van AAV5 en AAV9. De test toonde ook aan dat, in tegenstelling tot veel van de gemeenschappelijke serotype AAPs ter bevordering van heterologe Eiwitmantel vergadering door cross-complementatie, Snake AAP niet vergadering van AAV9 capsids bevordert. Bovendien laten we zien dat de keuze van de nuclease heeft grote invloed op de uitlezing van de stip vlek bepaling, en dus voor het kiezen van een optimale enzym is van cruciaal belang voor succesvolle beoordeling van AAV titers.
Introduction
Adeno-associated virus (AAV) is een kleine, niet-gehuld, single-stranded DNA-virus met een genoom van ongeveer 4,7 kilobases (kb). Het genoom van AAV bevat open-lezing frames (ORFs) voor de rep en cap genen. In 2010, werd een eerder onbekende nonstructural eiwit gecodeerd door een + 1 frame-verschoven ORF binnen het AAV2 GLB -gen ontdekt door Sonntag et al. en gevonden om te spelen een cruciale rol in de vergadering van AAV2 Eiwitmantel VP monomeer eiwitten in een virale Eiwitmantel1. Vergadering-activeren eiwit (AAP) is deze roman eiwit vernoemd naar de rol die het speelt bij het bevorderen van Eiwitmantel vergadering1.
De ORFs voor AAP geweest geïdentificeerde bioinformatically in het genoom van alle parvoviruses binnen het geslacht Dependoparvovirus, maar niet binnen het genoom van virussen van verschillende geslachten van het parvovirus familie1,2. Functionele studies van deze roman eiwit richtten zich aanvankelijk op de AAP van het prototype AAV2 (AAP2), die de essentiële rol van AAP2 in doelgerichtheid gedemonteerde VP eiwitten aan de nucleolus voor hun accumulatie en de vorming in volledig heeft vastgesteld capsids1,3,4gemonteerd. Het onvermogen van de capsids van de AAV2 te monteren in de afwezigheid van AAP expressie is onafhankelijk bevestigd door meerdere groepen, met inbegrip van ons1,2,3,4,5 . Latere studies op AAV serotypen 1, 8 en 9 bevestigd de kritische rol van AAPs in Eiwitmantel vergadering, als VP3 monomeer proteïnen van AAV1, 8, en 9 niet konden vormen een volledig geassembleerde Eiwitmantel bij gebrek aan mede uiting van AAP2.
Onlangs, door benaderingen die het gebruik van kwantitatieve dot omvatten blot testen, we onderzochten het vermogen van AAV1 om 12 VP3 monomeren te monteren in capsids in de afwezigheid van AAP expressie en het vermogen van AAP1 tot en met 12 ter bevordering van de vergadering van VP3 monomeren van heterologe serotypen. Deze studie is gebleken dat AAV4, 5 en 11 VP3 monomeren kunnen samenstellen zonder AAP. Bovendien bleek dat acht van de twaalf AAP serotypen we onderzocht (d.w.z.alles behalve AAP4, 5, 11 en 12) weergegeven van een brede mogelijkheid ter ondersteuning van Eiwitmantel vergadering van heterologe AAV serotype capsids, terwijl AAP4, 5, 11 en 12 weergegeven een aanzienlijk beperkte capaciteit in deze verwijzing6. Deze vier serotypen zijn fylogenetisch ver van de andere AAP serotypen2,3verwijderd. Bovendien heeft de studie significante heterogeniteit in subcellular lokalisaties van verschillende AAPs6ontdekt. Bovendien, het onderzoek heeft voorgesteld dat de strakke vereniging van AAP met gemonteerde capsids en de nucleolus, hét waarmerk van AAV2 Eiwitmantel vergadering, noodzakelijkerwijs kan niet worden uitgebreid tot andere serotypes met inbegrip van AAV5, 8, en 9, die weer nucleolar uitsluiting van geassembleerde capsids6. Dus, de gegevens die u uit de studie van eventuele bijzondere serotype AAP geldt niet in het algemeen voor alle AAP biologie. Deze raadselachtige karakter van AAP biologie onderstreept de noodzaak te onderzoeken van de rol en functie van elke AAP uit zowel de canonieke en de niet-canonieke AAV serotypen.
De biologische rol van AAP in Eiwitmantel vergadering kan worden beoordeeld door het bepalen van dat de volledig-verpakt AAV virale deeltjes titers geproduceerd in menselijke embryonale nier (HEK) 293 cellen, de meest gebruikte cellijn voor de productie van de vector van AAV, met of zonder AAP eiwit expressie. De standaardmethoden voor AAV kwantificatie zijn kwantitatieve PCR (qPCR)-gebaseerd testen7,8 en kwantitatieve dot vlek gebaseerde testen9. Andere methoden voor AAV virale deeltjes kwantificatie zoals enzyme-linked immunosorbent assay10,11 of optische dichtheid meting12 zijn niet ideaal voor afgeleid van vele verschillende AAV serotypen monsters of besmet met onzuiverheden (ruwe lysates of voedingsbodems), die vaak de monsters gebruikt voor AAV onderzoek. Op dit moment is qPCR meest gebruikte voor AAV kwantificatie; het is echter noodzakelijk te erkennen potentiële valkuilen van de qPCR gebaseerde bepaling, als de bepaling kunnen leiden tot systematische fouten en significante titer variaties13,14. PCR-gebaseerde testen worden beïnvloed door een aantal potentieel verstorende factoren, zoals de aanwezigheid van covalent gesloten terminal haarspelden in PCR sjablonen die een remmende werking amplificatie13. Zelfs een ervaren persoon kan introduceren potentieel storende factoren in een op qPCR gebaseerde assay onbewust13. Kwantitatieve dot blot testen zijn daarentegen een klassieke moleculaire biologie-techniek die geen genoom versterking en maakt gebruik van een veel eenvoudiger principe met een minimaal risico van fouten ten opzichte van de qPCR gebaseerde tests. De methode is minder technisch uitdagende; de test-resultaten zijn dus redelijk reproduceerbare zelfs door onervaren individuen.
In dit verslag beschrijven we de methodologische details van een kwantitatieve dot vlek assay we regelmatig gebruiken voor AAV vector kwantificatie en bieden een voorbeeld van hoe toe te passen de bepaling om te bestuderen van de vergadering-bevordering van rol van AAPs gemeen serotypen (AAV5 en AAV9) en een eerder genfunctieonderzoek AAP van Snake AAV14. In de natuur, AAV VP eiwitten en AAP eiwitten worden uitgedrukt in cis uit een enkel gen (dat wil zeggen, VP-AAP cis-complementatie), terwijl in de hier beschreven test, VP en AAP eiwitten worden geleverd in trans uit twee aparte plasmiden (d.w.z., VP-AAP trans-complementatie). Aangezien elke VP of AAP proteïne uit verschillende serotypen kan van elke onafhankelijke plasmide worden uitgedrukt, wordt het mogelijk om te testen van heterologe VP-AAP combinaties voor Eiwitmantel vergadering (d.w.z., VP-AAP Kruis-complementatie). Kort, AAV VP3 uit verschillende serotypen wordt uitgedrukt in HEK 293 cellen door plasmide DNA transfectie voor het inpakken van een genoom AAV vector in de aan- of afwezigheid van het cognaat serotype AAP, of in de aanwezigheid van een heteroloog serotype AAP. Na productie, cultuurmedia en cel lysates worden onderworpen aan een kwantitatieve analyse van dot, vlek te kwantificeren van het virale genoom binnen de Eiwitmantel-shell. De eerste stap van de stip blot test is voor de behandeling van de monsters met een nuclease verwijderen van contaminerende plasmide ANI’s en onverpakte AAV genoom in monsters. Niet te doen zou het verhogen van de signalen van de achtergrond in het bijzonder wanneer ongezuiverde monsters zijn vehiculumcontrolegroep. Dit wordt dan gevolgd door een protease-behandeling te breken van virale capsids en introductie nuclease-resistente virale genoom in monsteroplossingen. Volgende, virale genoom worden gedenatureerd, bevlekt op een membraan en gekruist met een virale genoom-specifieke DNA sonde voor de kwantificatie. In het voorbeeld assay gemeld hier, we laten zien dat de slang AAV VP3 Snake AAP voor Eiwitmantel vergadering vereist en dat Snake AAP is niet bevorderlijk voor de vergadering van AAV9 capsids in tegenstelling tot veel van de AAPs afgeleid van AAP-afhankelijke serotypen die ook vergadering van bevorderen kunnen heterologe serotype capsids. Tot slot brengen wij verslag een belangrijk voorbehoud qPCR of dot vlek gebaseerde AAV kwantificatie testen dat de keuze van de nuclease heeft grote invloed op de resultaten van de test.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit verslag, wordt het nut van kwantitatieve dot blot testen om te studeren AAV AAPs en hun rol in Eiwitmantel vergadering beschreven. Kennis die is opgedaan met deze studies kan gedetailleerde inzicht verwerven in de aangeboren verschillen in het proces van AAV Eiwitmantel vergadering en de functionele rol van AAPs tussen verschillende serotypen. In dit opzicht de AAV VP3-AAP Kruis-complementatie stip blot test bleek dat Snake AAV VP3 een strikte afhankelijkheid op de co uitdrukking van haar cognaat AAP voor Eiwitman…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Xiao Xiao aan de Universiteit van North Carolina te Chapel Hill voor het verstrekken van ons met de pEMBL-CMV-GFP plasmide. Wij danken Christopher Cheng en Samuel J. Huang voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gesteund door Public Health Service verleent (NIH R01 NS088399 en T32 EY232113).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
Riferimenti
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
- Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
- Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
- Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
- Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
- Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
- Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
- Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
- NEB, . 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , 302-368 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- . Bacterial Transformation Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017)
- . Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017)
- Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
- Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
- Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
- Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
- Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
- Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).
