En kvantitativ Dot Blot analysen for AAV titrering og bruk for funksjonell vurdering av Adeno-assosiert Virus montering-aktivere proteiner
Summary
Dette manuskriptet detaljer en enkel prikk blot analysen for kvantifisering av adeno-assosiert virus (AAV) titers og dens anvendelse å studere rollen til montering-aktivere proteiner (AAPs), en roman klasse av ikke-strukturell virale proteiner i alle AAV serotyper, fremme montering av capsids fra beslektet og heterologous AAV serotyper.
Abstract
Mens adeno-assosiert virus (AAV) er allment akseptert som en attraktiv vektor for genterapi, fungerer den også som en modell virus for å forstå virus biologi. I sistnevnte respekt, har den nylige oppdagelsen av en ikke-strukturell AAV protein, kalt montering-aktivere protein (AAP), kaste nytt lys over prosessene i nasjonalforsamling viral kapsid VP proteiner i en kapsid. Selv om mange AAV serotyper krever AAP for samlingen, vi har nylig rapportert at AAV4, 5, og 11 er unntak til denne regelen. Videre har vi vist at AAPs og samlet capsids av forskjellige serotyper lokalisere til ulike subcellular rom. Dette uventet heterogenitet i biologiske egenskaper og funksjonelle rollene som AAPs blant annet AAV serotyper understreker viktigheten av studier på AAPs avledet fra mangfoldig serotyper. Dette manuskriptet detaljer en enkel prikk blot analysen for AAV kvantifisering og dens anvendelse å vurdere AAP avhengighet og serotype spesifisitet i kapsid samling. For å demonstrere nytten av denne dot blot analysen, satt vi ut for å karakterisere kapsid montering og AAP avhengighet av slange AAV, en tidligere uncharacterized reptil AAV, samt AAV5 og AAV9, som har tidligere vist AAP uavhengig og AAP-avhengig serotyper, henholdsvis. Analysen avdekket at slange AAV kapsid montering krever slange AAP og kan ikke forfremmes av AAPs fra AAV5 og AAV9. Analysen viste at, i motsetning til mange av de vanlige serotype AAPs som fremmer heterologous kapsid montering av kryss-complementation, slange AAP ikke fremme montering av AAV9 capsids. I tillegg viser vi at valget av nuclease påvirker betydelig avlesning av dot blot analysen, og dermed velge en optimal enzymet er avgjørende for vellykket vurdering av AAV titers.
Introduction
Adeno-assosiert virus (AAV) er en liten, ikke-innhyllet, enkelt-strandet DNA virus med et genom omtrent 4,7 kilobases (kb). AAV genomet inneholder åpne-lesing rammer (ORFs) for rep og cap gener. I 2010, ble en tidligere uidentifiserte nonstructural protein kodet av en 1 ramme-forskjøvet ORF innen AAV2 cap genet oppdaget av Sonntag et al. og funnet for å spille en avgjørende rolle i forsamlingen AAV2 kapsid VP monomer proteiner virus kapsid1. Denne roman protein kalles montering-aktivere protein (AAP) etter rollen den spiller i å fremme kapsid montering1.
ORFs for AAP har vært identifisert bioinformatically i genomer av alle parvoviruses i slekten Dependoparvovirus, men ikke i genomer virus av ulike genera parvovirus familie1,2. Funksjonell studier av dette roman protein var utgangspunktet fokusert på the AAP fra prototypen AAV2 (AAP2), som har etablert den viktige rollen AAP2 i målretting umontert VP proteiner til kjerne for akkumulering og formasjon i fullt samlet capsids1,3,4. Manglende evne til AAV2-capsids å montere i fravær av AAP uttrykk har vært uavhengig bekreftet av flere grupper, inkludert vår1,2,3,4,5 . Studier på AAV serotyper 1, 8 og 9 bekreftet den kritiske rollen AAPs i kapsid montering, som VP3 monomer proteiner av AAV1, 8 og 9 klarte ikke å danne en fullstendig montert kapsid i fravær av co uttrykk for AAP2.
Nylig gjennom tilnærminger som omfatter bruk av kvantitative dot blot analyser, vi undersøkt muligheten for AAV1 å 12 VP3 monomerer å samle til capsids i fravær av AAP uttrykk og evne til AAP1 12 å fremme montering av VP3 monomerer fra heterologous serotyper. Denne studien har avdekket at AAV4, 5 og 11 VP3 monomerer kan sette sammen uten AAP. I tillegg ble det funnet at åtte av de tolv AAP serotypene vi (dvs.alle bortsett fra AAP4, 5, 11 og 12) vises en bred evne til å støtte kapsid montering av heterologous AAV serotype capsids, mens AAP4, 5, 11 og 12 vises en vesentlig begrensede evne i denne forbindelse6. Disse fire serotyper er phylogenetically fjernt fra de andre AAP serotyper2,3. Videre har studier avdekket betydelig heterogene i subcellular lokaliseringer forskjellige AAPs6. Videre studier har antydet at tett tilknytningen av AAP samlet capsids og kjerne, kjennetegnet av AAV2 kapsid montering, ikke nødvendigvis bli utvidet til andre serotyper inkludert AAV5, 8 og 9, som viser nucleolar utelukkelse av samlet capsids6. Dermed er opplysningene du får studiet av noen bestemt serotype AAP ikke grovt gjelder alle AAP biologi. Slike forvirrende natur AAP biologi understreker behovet for å undersøke rolle og funksjon av hver AAP fra både kanoniske og ikke-kanoniske AAV serotyper.
Biologiske rollen AAP i kapsid samling kan vurderes ved å bestemme de ferdige versjonen AAV viral partikkel titers produsert i menneskelige embryonale nyre (HEK) 293 celler, mest brukte cellen linjen for AAV vektor produksjon, med eller uten AAP protein uttrykk. Standardmetodene for AAV kvantifisering er kvantitative PCR (qPCR)-baserte analyser7,8 og kvantitative dot blot-basert søk9. Andre metoder for AAV viral partikkel kvantifisering som enzym knyttet immunosorbent analysen10,11 eller optisk densitet måler12 er ikke ideelt for prøver fra mange forskjellige AAV serotyper eller vareprøver forurenset med urenheter (rå lysates eller kultur medier), som ofte eksemplene brukes til AAV forskning. Foreløpig er qPCR mest brukt for AAV kvantifisering; Imidlertid er det nødvendig å erkjenne potensielle advarsler til qPCR-baserte analysen, som analysen kan føre til systemisk feil og betydelig titer variasjoner13,14. PCR-baserte analyser påvirkes av en rekke potensielt confounding faktorer, slik som tilstedeværelsen av covalently lukket terminal hårnåler i PCR-maler som hemmer forsterkning13. Selv en erfaren person kan presentere muligheter forvirrende faktorer inn i en qPCR-basert analysen uvitende13. Kvantitativ dot blot analyser er en klassisk molekylærbiologi teknikk som ikke involverer genomet forsterkning og bruker en mye enklere prinsippet med minimal risiko for feil i forhold til qPCR-baserte analyser. Metoden er mindre teknisk utfordrende; Derfor er analyseresultatene rimelig reproduserbar selv av uerfarne individer.
I denne rapporten beskriver vi metodologiske detaljene for en kvantitativ dot blot analysen vi rutinemessig bruk for AAV vektor kvantifisering og gi et eksempel på hvordan bruke analysen for å studere montering-fremme rollen AAPs felles serotyper (AAV5 og AAV9) og tidligere uncharacterized AAP slange AAV14. I naturen, AAV VP proteiner og AAP proteiner er uttrykt i cis fra ett gen (dvs., VP-AAP cis-complementation), mens i analysen beskrevet her, VP og AAP proteiner leveres i trans fra to separate plasmider (dvs., VP-AAP trans-complementation). Siden hver VP eller AAP protein fra forskjellige serotyper kan uttrykkes fra hver uavhengige plasmider, blir det mulig å teste heterologous VP-AAP kombinasjoner for kapsid montering (dvs., VP-AAP kors-complementation). Kort, AAV VP3 fra ulike serotyper er uttrykt i HEK 293 celler ved plasmider DNA transfection pakke en AAV vektor genomet i tilstedeværelse eller fravær av beslektet serotype AAP, eller i nærvær av en heterologous serotype AAP. Etter produksjon, kultur medier og celle lysates er utsatt for en prikk blot analysen å kvantifisere viral genomet kapsid skallet. Det første trinnet til dot blot analysen er å behandle prøver med en nuclease å fjerne skadelige plasmider DNAs og emballert AAV genomer i prøvene. Gjør det ville øke bakgrunnen signalene spesielt når urenset eksempler er assayed. Dette etterfølges av en protease behandling for å bryte viral capsids og slipp nuclease-resistente virus genomer i utvalg løsninger. Neste, viral genomer denaturert, strøket på en membran og hybridiserte med en viral genomet-spesifikke DNA sonde for kvantifisering. Eksempel analysen rapporterte her, viser vi at slange AAV VP3 krever slange AAP for kapsid montering og at slange AAP ikke fremme montering av AAV9 capsids i motsetning til mange av AAPs fra AAP-avhengige serotyper som kan også fremme nasjonalforsamling heterologous serotype capsids. Til slutt, vi rapporterer en viktig påminnelse til qPCR eller dot blot-baserte AAV kvantifisering søk at valget av nuclease betydelig innvirkning på analyseresultatene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nytten av kvantitative dot blot analyser AAV AAPs og deres rolle i kapsid montering er beskrevet i denne rapporten. Kunnskapen fra disse studiene kan gi detaljert innblikk i medfødte forskjellene under AAV kapsid montering og funksjonelle rolle AAPs mellom forskjellige serotyper. I denne forbindelse AAV VP3-AAP kors-complementation dot blot analysen viste at slange AAV VP3 vises en streng avhengighet på co uttrykk for sin beslektet AAP for kapsid montering og at slange AAP ikke fremme kapsid montering av heterologous s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Xiao Xiao ved University of North Carolina i Chapel Hill for å gi oss pEMBL-CMV-GFP plasmider. Vi takker Christopher Cheng og Samuel J. Huang for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av helsevesenet gir (NIH R01 NS088399 og T32 EY232113).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
Riferimenti
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
- Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
- Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
- Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
- Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
- Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
- Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
- Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
- NEB, . 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , 302-368 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- . Bacterial Transformation Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017)
- . Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017)
- Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
- Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
- Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
- Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
- Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
- Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).
