Évaluation de sperme de poissons à l’aide de logiciels et de dispositifs de refroidissement
Summary
Le présent protocole décrit une procédure d’évaluation de sperme du poisson à l’aide de spermogramme assistée par ordinateur et de dispositifs de refroidissement. Le logiciel donne un rapide, précis et l’analyse quantitative de la qualité du sperme poisson basée sur la motilité des spermatozoïdes, qui peut être un outil utile pour l’aquaculture afin d’améliorer le succès de la reproduction.
Abstract
Pour l’évaluation de qualité de gamètes, il y a des techniques innovantes, rapides et quantitatives pouvant fournir des données utiles pour l’aquaculture. Systèmes informatisés pour l’analyse du sperme ont été développées pour mesurer plusieurs paramètres et un du plus souvent mesurée est la motilité des spermatozoïdes.
Au départ, cette technologie informatique a été conçue pour les espèces de mammifères, mais il peut également être utilisé pour l’analyse de sperme des poissons. Les poissons ont des caractéristiques spécifiques qui peuvent affecter le sperme évaluation comme un temps de motilité court après l’activation et, dans certains cas, adaptation aux températures inférieures. Ainsi, il est nécessaire de modifier les composants logiciels et du matériel pour faire l’analyse de motilité plus efficace pour l’analyse du sperme poisson. Pour des spermatozoïdes chez les mammifères, la plaque chauffante est utilisée pour maintenir les températures optimales de spermatozoïdes. Toutefois, pour certaines espèces de poissons, il est avantageux d’utiliser une température plus basse pour prolonger la durée de la motilité, étant donné que les spermatozoïdes restent actives pendant moins de 2 min. Dispositifs de refroidissement sont donc nécessaires de réfrigérer les échantillons à température constante pendant la durée de l’analyse, le microscope optique. Ce protocole décrit l’analyse de la motilité de sperme du poisson à l’aide de logiciels pour l’analyse du sperme et de nouveaux dispositifs afin d’optimiser les résultats de refroidissement.
Introduction
L’efficacité de la reproduction dépend de la qualité de ces deux gamètes (oeufs et du sperme)1,2. C’est le principal facteur qui contribue à une fécondation réussie, permettant le développement d’une descendance viable3,4. L’évaluation pratique de la qualité des gamètes est le meilleur outil pour définir le potentiel de fécondité d’un spécimen.
Mélange de spermatozoïdes provenant de plusieurs mâles est une pratique courante dans la production de nombreuses espèces commerciales aquatique4. Cependant, la variabilité de sperme entre mâles peut conduire à la compétition spermatique et, par conséquent, pas tous les hommes contribuent également au pool génétique5. En ce sens, l’évaluation correcte des fonctionnalités de chaque éjaculat/spermatozoïdes, tels que la motilité, est fondamentale pour obtenir des informations au sujet de la fertilité masculine individuelle potentiel discriminatoires. L’observation directe de la motilité des spermatozoïdes peut produire des données inexactes et subjectives car elle nécessite temps et l’expérience, ce qui conduit à un manque d’uniformité et d’incompatibilité des résultats6,7. Cependant, il y a beaucoup de techniques innovantes, rapides et quantitatives qui peut fournir un sperme fiable qualité analyse2,4.
Spermogramme assistée par ordinateur a été développé pour offrir des données précises sur la qualité de sperme8. Cette technologie comprend le développement d’un logiciel associé à un microscope à contraste de phase qui permet l’évaluation de la motilité des spermatozoïdes. Cependant, un facteur limitatif du paramètre de la motilité est la fréquence d’images de la caméra vidéo. Spermatozoïdes individuels trajectoires sont basés sur les spermatozoïdes tête position centroïde dans images consécutives d’enregistrements vidéo, qui est en corrélation avec le mouvement flagellaire patrons3,9,10, 11. les principaux paramètres cinétiques mesurés sont la vitesse linéaire (VSL), la vitesse curviligne (VCL) et la vitesse moyenne des chemins (VAP). VSL est la distance entre le début et le virage pris par les spermatozoïdes divisés par le temps. VCL est la vitesse réelle le long de la trajectoire exacte prise par les spermatozoïdes. VAP est la vitesse sur un tracé lissée dérivée de trajectoire. Ces paramètres permettent de plus d’informations cinétiques, y compris linéarité (LIN), rectitude (STR), wobble (WOB) et battant mesures comme l’amplitude de mouvement latéral de la tête (ALH) et la fréquence de battement-Croix (BCF)4,10.
Le système d’analyse de sperme a été initialement utilisé pour les espèces de mammifères, et l’une des exigences pour le système doit fonctionner à la température du corps du donneur (environ 37 ° C). Ce logiciel pourrait également être utilisé pour les espèces de poissons ; mais, il est nécessaire de faire quelques adaptations afin de réduire l’erreur des résultats d’analyse de sperme. Chez certaines espèces de poissons, tels que les salmonidés et les anguilles8,12, la fécondation a eu lieu à basse température (environ 4 ° C)2,4. Ainsi, les dispositifs de refroidissement devraient être élaboré afin d’éviter des conditions de travail pénibles. En outre, les spermatozoïdes de poissons sont immobiles dans le liquide séminal et nécessitent un choc osmotique pour activer la motilité. Pour les espèces d’eau douce, le milieu de l’activateur devrait avoir osmolalité hypotonique, tandis que les espèces marines, le milieu doit être hypertonique. Toutefois, pour certaines espèces, comme les salmonidés, la concentration en ions pourrait également être important3,4,9. Après activation, poisson sperme est caractérisé par une rapide diminution de la motilité (moins de 2 min)13,14 et haute vitesse, étant essentiel pour déterminer la fréquence d’images optimale afin d’obtenir des données fiables15.
Cette étude vise à concevoir et appliquer des systèmes de réfrigération pour les échantillons de sperme de poissons. En outre, ce protocole définit comment déterminer la cadence optimale pour la mise en place de protocoles normalisés selon les espèces. L’utilisation de ce protocole ouvre de nouveaux horizons dans le cadre de l’évaluation séminal du poisson, à l’aide de l’anguille européenne comme un modèle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le logiciel d’analyse de sperme utilisé dans le présent protocole a servi par des chercheurs dans le monde entier pour les différentes espèces, y compris les poissons. Cependant, les poissons ont certaines caractéristiques spécifiques qui peuvent influer sur l’évaluation de sperme. Spermatozoïdes de poissons a montré la grande vitesse au moment de l’activation qui décline rapidement et mène à une courte période de motilité après activation. En outre, la température de reproduction dépend de l’esp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a reçu un financement de l’Association de coût (l’alimentation et l’Agriculture coût Action FA1205 : AQUAGAMETE et programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne en vertu de la Marie Sklodowska-Curie du projet IMPRESS (GA No 642893). Nous tenons à remercier toute l’équipe scientifique de PROiSER, plus précisément à l’étudiant Alberto Vendrell Bernabéu, pour sa participation active dans l’enregistrement vidéo de ce projet.
Materials
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
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