Fisch Sperma Bewertung mit Software und Kühlgeräte
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren der Fisch Sperma Bewertung mit computerunterstützten Spermiogramm und Kühlgeräten. Die Software bietet eine schnelle, genaue und Quantitative Analyse von Fisch Spermienqualität basierend auf Motilität der Spermien, die ein nützliches Werkzeug in der Aquakultur Reproduktionserfolg zu verbessern sein kann.
Abstract
Für die Qualitätsbewertung der Gameten gibt es innovative, schnelle und quantitative Techniken, die nützliche Hinweise für die Aquakultur liefern können. EDV-Systeme für Spermiogramm wurden entwickelt, um mehrere Parameter zu messen und eines der am häufigsten gemessenen ist die Beweglichkeit der Spermien.
Zunächst wurde dieser Computertechnologie für Säugetierarten, entwickelt, obwohl es auch für Fisch-Sperma-Analyse verwendet werden kann. Fische haben Besonderheiten, die Spermien Bewertung wie eine kurze Motilität Zeit nach der Aktivierung und in einigen Fällen Anpassung an niedrigere Temperaturen beeinflussen können. So ist es notwendig, sowohl Hardware als auch Software-Komponenten, Motilität Analyse effizienter für Fisch Spermiogramm machen zu ändern. Für Säugetier-Samenzellen wird die Heizplatte verwendet, um optimale Temperaturen von Spermien zu erhalten. Für einige Fischarten ist es jedoch vorteilhaft, eine niedrigere Temperatur zu verwenden, um die Dauer der Motilität, zu verlängern, da das Sperma weniger als 2 min. lang aktiv bleiben. Kühlgeräte sind daher notwendig, über die Zeit der Analyse, einschließlich auf dem optischen Mikroskop Proben bei konstanter Temperatur im Kühlschrank zu lagern. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der Fisch Samenzellenmotilität mit Software für Spermiogramm und neuen Kühlgeräten um die Ergebnisse zu optimieren.
Introduction
Die Wirksamkeit der Wiedergabe hängt von der Qualität der beiden Gameten (Eizellen und Spermien)1,2. Dies ist der wichtigste Faktor, der zur erfolgreichen Befruchtung, soll die Entwicklung von lebensfähige Nachkommen3,4beiträgt. Die günstige Bewertung der Gameten Qualität ist das beste Werkzeug für die Definition der Fruchtbarkeit Potenzial einer Probe.
Mischen von Sperma von mehreren Männern, ist eine gängige Praxis bei der Herstellung von vielen aquatischen Nutztierarten4. Jedoch die Spermien Variabilität zwischen Männern zu Spermien Wettbewerb führen kann und folglich nicht alle Männer tragen ebenso zu den gen-Pool-5. In diesem Sinne ist die korrekte Beurteilung der einzelnen Ejakulat/Spermien Features, z. B. Motilität, grundlegend für diskriminierend über einzelne männliche Fruchtbarkeit potenzielle informieren. Direkter Beobachtung der Beweglichkeit der Spermien kann ungenaue und subjektiven Daten produzieren, wie es erfordert Zeit und Erfahrung, führt zu einem Mangel an Konsistenz und Unvereinbarkeit der Ergebnisse6,7. Allerdings gibt es viele innovative, schnelle und quantitative Techniken, die eine zuverlässige Spermien Qualität Analyse2,4bieten können.
Computergestützte Spermiogramm wurde entwickelt, um genaue Daten über Spermien Qualität8bieten. Diese Technologie umfasst die Entwicklung von Software verbunden mit einem Phase-Kontrast-Mikroskop, mit dem die Beurteilung der Beweglichkeit der Spermien können. Ein limitierender Faktor der Motilität Parameter ist jedoch die Frame-Rate der Videokamera. Einzelne Bahnen auf Spermien basieren Spermien Kopf Zentroid Position in aufeinanderfolgenden Rahmen von Videoaufnahmen, die mit den flagellar Bewegung Muster3,9,10, korreliert ist 11. die wichtigsten kinetischen Parameter gemessen sind die lineare Geschwindigkeit (VSL), krummlinigen Geschwindigkeit (VCL) und durchschnittliche Bahngeschwindigkeit (VAP). VSL ist der Abstand zwischen den Start- und Endpunkt durch die Spermien geteilt durch Zeit genommen. VCL ist die reale Geschwindigkeit entlang der präzise Flugbahn genommen durch die Spermien. VAP ist die Geschwindigkeit auf eine abgeleitete geglätteten Weg der Flugbahn. Diese Parameter ermöglichen zusätzlichen kinetische Informationen, einschließlich Linearität (LIN), Geradheit (STR), wackeln (WOB) und schlagen Messungen wie Amplitude der seitlichen Kopfbewegung (ALH) und Beat-Kreuz Frequenz (BCF)4,10.
Die Sperma-Analyse-System wurde ursprünglich für Säugetierarten verwendet, und eine der Voraussetzungen für das System ist bei der Körpertemperatur des Spenders (etwa 37 ° C) betrieben. Diese Software könnte auch für Fischarten verwendet werden; Obwohl es einige Anpassungen, die Fehler der Spermien Analyseergebnisse zu reduzieren muss. Bei einigen Fischarten wie Salmoniden und Aal8,12tritt Befruchtung bei niedriger Temperatur (ca. 4 ° C)2,4. Kühlgeräte sollten so entwickelt werden, um unangenehme Arbeitsbedingungen zu vermeiden. Darüber hinaus Fisch Spermien sind in der Samenflüssigkeit unbewegten und erfordern einen osmotischen Schock, Motilität zu aktivieren. Für Süßwasserarten sollte das Aktivator Medium hypotone Osmolalität haben, während das Medium für Meerestiere hypertonen sein sollte. Allerdings könnte für einige Arten als Salmoniden, die Ionenkonzentration auch wichtig3,4,9sein. Nach der Aktivierung ist Fisch Sperma gekennzeichnet durch einen raschen Rückgang der Motilität (weniger als 2 min.)13,14 und hoher Geschwindigkeit, wird entscheidend für die optimale Bildrate zu zuverlässigen Daten15bestimmen.
Die Ziele dieser Studie sind design und Kühlanlagen für Fisch Spermaproben anwenden. Dieses Protokoll definiert zudem die optimale Frameraten für die Einrichtung von Standardprotokollen je nach Tierart zu bestimmen. Die Verwendung dieses Protokolls öffnet neue Türen im Zusammenhang mit Fisch bahnbrechenden Bewertung, mit der europäische Aal als Modell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für verschiedene Arten, darunter Fisch ist die Sperma-Analyse-Software in diesem Protokoll verwendeten von Forschern weltweit eingesetzt. Fische haben jedoch einige Besonderheiten, die die Spermien Bewertung beeinflussen können. Fisch-Spermien zeigte high-Speed im Moment der Aktivierung, die schnell sinkt und führt zu einer kurzen Zeit der Motilität nach der Aktivierung. Außerdem die Temperatur der Reproduktion ist Spezies-abhängig, und in einigen Fällen könnte um 4 ° C2,<sup c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wird finanziell unterstützt von der COST-Vereinigung (Lebensmittel und Landwirtschaft COST Action FA1205: AQUAGAMETE und der Europäischen Union Programm Horizont 2020 Forschung und Innovation unter Marie Sklodowska-Curie Projekt IMPRESS (GA Nr. 642893). Wir möchten das Wissenschaftlerteam des PROiSER, speziell für den Schüler Alberto Vendrell Bernabéu, für seine aktive Mitarbeit in der Videoaufzeichnung dieses Projektes danken.
Materials
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
Riferimenti
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