Valutazione di sperma di pesce utilizzando Software e dispositivi di raffreddamento
Summary
Il presente protocollo descrive una procedura di valutazione di sperma di pesce mediante analisi computerizzata dello sperma e dispositivi di raffreddamento. Il software dà un rapido, accurato e l’analisi quantitativa della qualità dello sperma di pesce basata sulla motilità degli spermatozoi, che può essere un utile strumento nel settore dell’acquacoltura per migliorare il successo di riproduzione.
Abstract
Per la valutazione della qualità dei gameti, esistono tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire dati utili per l’acquacoltura. Sistemi computerizzati per l’analisi dello sperma sono stati sviluppati per misurare diversi parametri e uno dei più comunemente misurato è la motilità degli spermatozoi.
Inizialmente, questa tecnologia informatica è stata progettata per specie di mammiferi, anche se può anche essere utilizzato per l’analisi dello sperma dei pesci. I pesci hanno caratteristiche specifiche che possono influenzare la sperma valutazione come un momento di breve motilità dopo l’attivazione e, in alcuni casi, adattamento a temperature più basse. Pertanto, è necessario modificare i componenti hardware e software per analisi di motilità più efficiente per l’analisi dello sperma dei pesci. Per gli spermatozoi dei mammiferi, la piastra di riscaldamento viene utilizzata per mantenere la temperatura ottima di spermatozoi. Tuttavia, per alcune specie di pesci, è vantaggioso utilizzare una temperatura più bassa per prolungare la durata della motilità, dato che gli spermatozoi rimangono attivi per meno di 2 min. Di conseguenza, dispositivi di raffreddamento sono necessari per refrigerare i campioni a temperatura costante sopra il tempo di analisi, tra cui il microscopio ottico. Questo protocollo descrive l’analisi di motilità dello sperma di pesce utilizzando il software per l’analisi dello sperma e nuovi dispositivi per ottimizzare i risultati di raffreddamento.
Introduction
L’efficacia di riproduzione dipende dalla qualità dei due gameti (uova e spermatozoi)1,2. Questo è il fattore principale che contribuisce alla fecondazione, permettendo lo sviluppo di prole vitale3,4. Il conveniente valutazione della qualità dei gameti è lo strumento migliore per definire il potenziale di fertilità di un esemplare.
Miscelazione di sperma da più maschi è una pratica comune nella produzione di molte specie acquatiche commerciali4. Tuttavia, la variabilità di sperma tra maschi può portare a concorrenza dello sperma e, di conseguenza, non tutti i maschi sono ugualmente contribuendo al pool genico5. In questo senso, la corretta valutazione delle caratteristiche individuali eiaculare/spermatozoi, come motilità, è fondamentale per ottenere informazioni discriminatorie per quanto riguarda la fertilità maschile individuale potenziale. Osservazione diretta di motilità dello sperma può produrre dati inesatti e soggettivi come richiede tempo ed esperienza, che porta a una mancanza di coerenza e incompatibilità di risultati6,7. Tuttavia, ci sono molte tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire un affidabile sperma qualità analisi2,4.
Analisi computerizzata dello sperma è stata sviluppata per offrire dati accurati su sperma qualità8. Questa tecnologia comprende lo sviluppo di software associato con un microscopio di contrasto di fase che permette la valutazione della motilità spermatica. Tuttavia, un fattore limitante del parametro motilità è la frequenza dei fotogrammi della telecamera. Individuali degli spermatozoi traiettorie si basano su spermatozoi testa posizione di baricentro in fotogrammi consecutivi di registrazioni video, che è correlata con il movimento flagellare modelli3,9,10, 11. i principali parametri cinetici misurati sono la velocità lineare (VSL), la velocità curvilinea (VCL) e la velocità di percorso medio (VAP). VSL è la distanza tra l’inizio e il punto finale presi dagli spermatozoi divisi da tempo. VCL è la reale velocità lungo la traiettoria precisa presa di spermatozoi. VAP è la velocità lungo un percorso levigato derivata della traiettoria. Questi parametri consentono ulteriori informazioni cinetiche, tra cui linearità (LIN), rettilineità (STR), wobble (WOB) e misurazioni di battitura come ampiezza di movimento laterale della testa (ALH) e frequenza di battimento-Croce (BCF)4,10.
Il sistema di analisi dello sperma è stato originariamente utilizzato per specie di mammiferi, e uno dei requisiti per il sistema è quello di operare alla temperatura corporea del donatore (circa 37 ° C). Questo software potrebbe essere utilizzato anche per le specie ittiche; anche se, è necessario effettuare alcuni adattamenti per ridurre l’errore di risultati di analisi dello sperma. In alcune specie di pesci, come i salmonidi e anguille8,12, la fecondazione avviene a bassa temperatura (circa 4 ° C)2,4. Così, dispositivi di raffreddamento dovrebbero essere sviluppato per evitare scomode condizioni di lavoro. Inoltre, gli spermatozoi di pesce sono immotile nel liquido seminale e richiedono un shock osmotico per attivare la motilità. Per le specie d’acqua dolce, il mezzo di attivatore dovrebbe avere osmolalità ipotonico, mentre per le specie marine il mezzo dovrebbe essere ipertonico. Tuttavia, per alcune specie, come i salmonidi, la concentrazione di ioni potrebbe anche essere importante3,4,9. Dopo l’attivazione, sperma di pesce è caratterizzato da una rapida diminuzione della motilità (meno di 2 min)13,14 e ad alta velocità, essendo essenziale per determinare la frequenza di fotogrammi ottimale per ottenere dati affidabili15.
Gli obiettivi di questo studio sono per progettare e applicare sistemi di refrigerazione per campioni di sperma di pesce. Inoltre, il presente protocollo definisce le modalità determinare i tassi di fotogrammi ottimale per l’istituzione di protocolli standard a seconda della specie. L’utilizzo di questo protocollo apre nuove porte nel contesto della valutazione seminale pesce, utilizzando l’anguilla europea come un modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il software di analisi dello sperma utilizzato in questo protocollo è stato utilizzato dai ricercatori in tutto il mondo per le diverse specie, tra cui pesce. Tuttavia, i pesci hanno alcune caratteristiche specifiche che possono influenzare la valutazione di sperma. Spermatozoi di pesce ha mostrati ad alta velocità al momento dell’attivazione che declina rapidamente e conduce ad un a breve termine della motilità dopo l’attivazione. Inoltre, la temperatura della riproduzione è specie-dipendente e, in alcuni casi, potr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dall’associazione di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE, programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell’Unione europea sotto il Marie Sklodowska-Curie progetto IMPRESS (GA No 642893). Vorremmo ringraziare il team scientifico di PROiSER, in particolare allo studente Alberto Vendrell Bernabéu, per la sua partecipazione attiva nella registrazione video di questo progetto.
Materials
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
Riferimenti
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