Evaluación del esperma de pescado utilizando Software y equipos de refrigeración
Summary
El presente Protocolo describe un procedimiento de evaluación del esperma de pescado utilizando el análisis de los espermatozoides asistido por ordenador y equipos de refrigeración. El software ofrece una rápida, precisa y análisis cuantitativo de la calidad del esperma de pescado basada en motilidad de espermatozoides, que puede ser una herramienta útil en la acuicultura para mejorar el éxito de la reproducción.
Abstract
Para la evaluación de la calidad de gametos, hay técnicas innovadoras, rápidas y cuantitativas que pueden proporcionar datos útiles para la acuicultura. Sistemas computarizados para el análisis de la esperma se desarrollaron para medir varios parámetros y uno de los más comúnmente medido es la movilidad de los espermatozoides.
Inicialmente, esta tecnología fue diseñada para especies de mamíferos, aunque también puede ser utilizado para el análisis de esperma de peces. Peces tienen características específicas que pueden afectar el esperma evaluación como un momento de poca motilidad después de la activación y, en algunos casos, adaptación a temperaturas más. Por lo tanto, es necesario modificar los componentes tanto de software como de hardware para hacer análisis de motilidad más eficientes para el análisis de esperma de peces. Mamíferos de los espermatozoides, la placa de calefacción se utiliza para mantener temperaturas óptimas de los espermatozoides. Sin embargo, para algunas especies de peces, es ventajoso utilizar una temperatura más baja para prolongar la duración de la movilidad, ya que los espermatozoides permanecen activos por menos de 2 min. Por lo tanto, dispositivos de enfriamiento están necesarios refrigerar las muestras a temperatura constante durante el tiempo de análisis, incluyendo en el microscopio óptico. Este protocolo describe el análisis de la motilidad del esperma de pescado utilizando el software para el análisis de la esperma y refrigeración nuevos dispositivos para optimizar los resultados.
Introduction
La eficacia de la reproducción depende de la calidad de ambos gametos (óvulos y espermatozoides)1,2. Este es el principal factor que contribuye a la fertilización exitosa, permitiendo el desarrollo de crías viables3,4. La conveniente evaluación de la calidad de gametos es la mejor herramienta para definir el potencial de fertilidad de una muestra.
Mezclando la esperma de varios machos es una práctica común en la producción de muchas especies comerciales4. Sin embargo, la variabilidad de esperma entre los hombres puede conducir a la competencia de esperma y, en consecuencia, no todos los varones están contribuyendo igualmente a la piscina de gene5. En este sentido, la correcta evaluación de características de eyaculado/espermatozoides individuales, tales como movilidad, es fundamental obtener información discriminatoria con respecto a la fertilidad masculina individual posibles. Observación directa de la motilidad espermática puede producir datos imprecisos y subjetivos ya que requiere tiempo y experiencia, que conduce a una falta de coherencia e incompatibilidad de resultados6,7. Sin embargo, hay muchas técnicas innovadoras, rápidas y cuantitativas que pueden proporcionar una calidad de esperma confiable análisis2,4.
Análisis de los espermatozoides asistido por ordenador fue desarrollado para ofrecer datos precisos sobre esperma calidad8. Esta tecnología incluye el desarrollo de software asociado con un microscopio de contraste de fase que permite la evaluación de la motilidad espermática. Sin embargo, un factor limitante del parámetro de movilidad es la velocidad de fotogramas de la cámara. Los espermatozoides trayectorias se basan en espermatozoides cabeza posición centroide en fotogramas consecutivos de grabaciones de vídeo, que se correlaciona con el movimiento flagelar patrones3,9,10, 11. los principales parámetros cinéticos medidos son la velocidad de línea recta (VSL), velocidad curvilínea (VCL) y velocidad promedio ruta (VAP). VSL es la distancia entre el inicio y el punto final de los espermatozoides divididos por tiempo. VCL es la velocidad real a lo largo de la trayectoria exacta tomada por los espermatozoides. VAP es la velocidad a lo largo de una trayectoria suavizada derivada de trayectoria. Estos parámetros permiten obtener información cinética adicional, incluyendo linealidad (LIN), rectitud (STR), bamboleo (WOB) y mediciones de golpeo como amplitud del movimiento lateral de la cabeza (ALH) y frecuencia de ritmo-Cruz (BCF)4,10.
El sistema de análisis de esperma se utilizó originalmente para especies de mamíferos, y uno de los requisitos para el sistema debe funcionar a la temperatura del cuerpo del donante (unos 37 ° C). Este software también podría ser utilizado para especies de peces; Aunque, es necesario hacer algunas adaptaciones para reducir el error de los resultados de análisis de esperma. En algunas especies de peces como los salmónidos y anguila8,12, la fertilización se produce a baja temperatura (alrededor de 4 ° C)2,4. Así, equipos de refrigeración deben ser desarrollado para evitar las condiciones de trabajo incómodas. Además, fish de espermatozoides son fijos en el líquido seminal y requieren un choque osmótico para activar la motilidad. Para especies de agua dulce, el medio activador debe tener osmolalidad hipotónica, mientras que para especies marinas, el medio debe ser hipertónico. Sin embargo, para algunas especies, como los salmónidos, la concentración del ion también podría ser importante3,4,9. Después de la activación, esperma de pez se caracteriza por una rápida disminución de motilidad (menos de 2 min)13,14 y alta velocidad, siendo vital para determinar la velocidad de fotogramas óptima para obtener datos confiables15.
Los objetivos de este estudio están diseñar y aplicar sistemas de refrigeración para las muestras de esperma de peces. Además, este protocolo define cómo determinar las tarifas de marco óptimo para el establecimiento de los protocolos dependiendo de la especie. El uso de este protocolo abre nuevas puertas en el contexto de la evaluación seminal de peces, utilizando la anguila europea como modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El software de análisis de esperma utilizado en este protocolo ha sido utilizado por investigadores en todo el mundo para diferentes especies, incluyendo peces. Sin embargo, los peces tienen algunas características específicas que pueden afectar la evaluación de espermatozoides. Espermatozoides de peces mostraron alta velocidad en el momento de la activación que declina rápidamente y conduce a un corto plazo de la movilidad después de la activación. Además, la temperatura de la reproducción depende de la especi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto ha recibido financiación de la Asociación de costos (alimentación y agricultura costo acción FA1205: AQUAGAMETE y programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea bajo la Marie Sklodowska-Curie proyecto IMPRESS (GA n 642893). Nos gustaría agradecer al equipo de científico de PROiSER, específicamente para el estudiante Alberto Vendrell Bernabéu, para su participación activa en la grabación de vídeo de este proyecto.
Materials
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
Riferimenti
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