Denne protokol beskriver en procedure af fisk sperm vurdering ved hjælp af computer-assisteret sædanalyse og afkøling enheder. Softwaren giver en hurtig, nøjagtig og kvantitativ analyse af fisk sædkvalitet baseret på sædcellerne motilitet, som kan være et nyttigt redskab i akvakultur at forbedre reproduktion succes.
For evaluering af kvaliteten af gamet er der innovative, hurtig og kvantitative teknikker, der kan give nyttige oplysninger for akvakultur. Edb-systemer til sædanalyse blev udviklet til at måle flere parametre og en af de mest almindeligt målte er sperm motilitet.
Oprindeligt, designet denne computerteknologi til pattedyrarter, selv om det kan også bruges til fisk sædanalyse. Fisk har specifikke egenskaber, der kan påvirke sædcellerne vurdering som en kort motilitet tid efter aktivering og i nogle tilfælde tilpasning til lavere temperaturer. Det er således nødvendigt at ændre både software og hardware komponenter for at effektivisere motilitet analyse for fisk sædanalyse. For pattedyr sperm bruges den varme plade til at opretholde optimale temperaturer på sædcellerne. Men for nogle fiskearter, det er fordelagtigt at bruge en lavere temperatur til at forlænge varigheden af motilitet, da spermen forbliver aktive i mindre end 2 min. Det er derfor nødvendigt at nedkøle prøver ved konstant temperatur over tid af analyse, herunder på optisk mikroskop afkøling enheder. Denne protokol beskriver analysen af fisk sperm motilitet ved hjælp af software til sædanalyse og ny afkøling enheder for at optimere resultaterne.
Effekten af reproduktion afhænger af kvaliteten af både mælke-(æg og sædceller)1,–2. Dette er den vigtigste faktor, der bidrager til vellykket befrugtning, giver mulighed for udvikling af levedygtige afkom3,4. Praktisk evaluering af gamet kvalitet er det bedste redskab til at definere frugtbarhed potentiale af et prøveeksemplar.
Blande sperm fra flere hanner er en fælles praksis i produktionen af mange akvatiske kommercielle arter4. Men sperm variabiliteten mellem hanner kan føre til sperm konkurrence, og derfor ikke alle mænd lige så bidrager til genpulje5. I denne forstand er den korrekte vurdering af individuelle ejakulere/sædcellerne funktioner, såsom motilitet, grundlæggende at indhente diskriminerende oplysninger vedrørende individuelle mandlige fertilitet potentielle. Direkte observation af sædkvalitet kan producere upræcise og subjektive data, da det kræver tid og erfaring, hvilket fører til en mangel på konsekvens og uforenelighed af resultater6,7. Men der er mange innovative, hurtig og kvantitative teknikker, der kan give en pålidelig sæd kvalitet analyse2,4.
Computerstøttet sædanalyse blev udviklet for at tilbyde nøjagtige data om sæd kvalitet8. Denne teknologi omfatter udvikling af software forbundet med en fase kontrast mikroskop, der giver mulighed for vurdering af sædkvalitet. Men en begrænsende faktor for motilitet parameter er frame rate af den video kameraet. Enkelte sædcellerne baner er baseret på sædcellerne hoved barycentrum position i på hinanden følgende frames på video-optagelser, som er korreleret med flagellaternes bevægelse mønstre3,9,10, 11. de vigtigste kinetiske parametre måles er lineær hastighed (VSL), krum hastighed (VCL) og gennemsnitlig sti hastighed (VAP). VSL er afstanden mellem start og end-point taget af sædcellerne divideret med tiden. VCL er den reelle hastighed langs den præcise bane truffet sædcellerne. VAP er hastighed langs en afledt glattes sti bane. Disse parametre giver mulighed for yderligere kinetic oplysninger, herunder linearitet (LIN), rethed (STR), wobble (WOB) og slå målinger som amplitude af lateral hoved bevægelse (ALH) og beat-cross frekvens (BCF)4,10.
Sperm analysesystem blev oprindeligt brugt til pattedyrarter, og et af kravene til systemet er at operere ved kropstemperatur af donor (ca. 37 ° C). Denne software kan også bruges til fiskearter; selv om det er nødvendigt at foretage nogle tilpasninger at reducere fejl af sperm analyseresultater. I nogle fiskearter såsom laksefisk og ål8,12, sker befrugtning ved lav temperatur (ca. 4 ° C)2,4. Således, køling enheder bør udvikles for at undgå ubehagelige arbejdsbetingelser. Derudover fisk sædcellerne er immotile i sædvæsken og kræver en osmotisk chok at aktivere motilitet. Ferskvandsfisk har activator medium hypotonic osmolalitet, mens for marine arter medium bør hypertonisk. Men for nogle arter, som laksefisk, ion koncentration kunne også være vigtigt3,4,9. Efter aktivering, er fisk sæd kendetegnet ved en hurtig nedgang af motilitet (mindre end 2 min)13,14 , og høj hastighed, er afgørende for at bestemme den optimale billedhastighed at få pålidelige data15.
Formålet med denne undersøgelse er at designe og anvende køleanlæg for fisk sperm prøver. Derudover definerer denne protokol hvordan til at bestemme de optimale frame rates til etablering af standardprotokoller dyrearten. Anvendelse af denne protokol åbner nye døre i forbindelse med fisk skelsættende evaluering, ved hjælp af den europæiske ål som en model.
Sperm analyse software, der anvendes i denne protokol er blevet brugt af forskere på verdensplan for forskellige arter, herunder fisk. Fisk har dog nogle specifikke funktioner, der kan påvirke sædcellerne vurdering. Fisk sædcellerne viste høj hastighed i øjeblikket aktivisering hvilke falder hurtigt og fører til en kort tid af motilitet efter aktivering. Desuden temperatur reproduktionshandlinger er arter-afhængige, og i nogle tilfælde kunne være ca. 4 ° C2,…
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt har modtaget støtte fra foreningen omkostninger (fødevarer og landbrug COST Action FA1205: AQUAGAMETE, og EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under Marie Sklodowska-Curie projekt IMPRESS (GA No 642893). Vi vil gerne takke det videnskabelige team af PROiSER, specielt til studerende Alberto Vendrell Bernabéu, for hans aktive deltagelse i videooptagelsen af dette projekt.
Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
Cooler block | PROiSER | Prototype | |
ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |