बैक्टीरियल लिपो के संवर्धन और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए एन टर्मिनल Lipopeptides की तैयारी
Summary
बैक्टीरियल लिपो का संवर्धन एक गैर ईओण surfactant चरण विभाजन विधि का उपयोग TLR परख या अंय अनुप्रयोगों में प्रत्यक्ष उपयोग के लिए वर्णित है । आगे कदम जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एन टर्मिनल tryptic lipopeptides तैयार करने के लिए विस्तृत रहे हैं ।
Abstract
लिपो बैक्टीरियल कोशिका लिफाफा और स्तनधारी सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रबल उत्प्रेरक के महत्वपूर्ण घटक हैं । दोनों कोशिका शरीर विज्ञान और इम्यूनोलॉजी के लिए उनके महत्व के बावजूद, बहुत उपंयास लिपोप्रोटीन रूपों के बारे में पता चला, कैसे वे संश्लेषित कर रहे हैं, और मेजबान उन्मुक्ति पर विभिंन रूपों का प्रभाव रहता है । लिपो पर गहन अध्ययन को सक्षम करने के लिए, इस प्रोटोकॉल का वर्णन बैक्टीरियल लिपोप्रोटीन संवर्धन के लिए एक विधि और एन के लिए तैयार-टर्मिनल tryptic lipopeptides संरचनात्मक निर्धारण के लिए मैट्रिक्स द्वारा असिस्टेड लेजर desorption ionization-उड़ान के समय मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मालदी-तोफ MS). बैक्टीरियल कोशिका झिल्ली से लिपोप्रोटीन निष्कर्षण और संवर्धन के लिए एक स्थापित ट्राइटन एक्स-११४ चरण विभाजन विधि पर विस्तार, प्रोटोकॉल गैर-लिपोप्रोटीन संदूषणों को दूर करने के लिए अतिरिक्त कदम शामिल है, लिपोप्रोटीन उपज में वृद्धि और शुद्धता. के बाद से लिपो सामांयतः टोल में उपयोग किया जाता है जैसे रिसेप्टर (TLR) परख, यह महत्वपूर्ण है कि पहले n-टर्मिनल संरचना की विशेषता मालदी-तोफ सुश्री के साथ साथ, एक विधि को अलग करने के लिए प्रस्तुत किया गया है ध्यान केंद्रित hydrophobic एन में समृद्ध पेप्टाइड्स-टर्मिनल मालदी द्वारा प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए उपयुक्त lipopeptides-तोफ ms/ms. लिपो कि सोडियम Dodecyl सल्फेट पाली से अलग किया गया है-Acrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) एक nitrocellulose झिल्ली को हस्तांतरित कर रहे हैं, के साथ सीटू में पचा trypsin, क्रमिक रूप से ध्रुवीय tryptic पेप्टाइड्स हटाने के लिए धोया, और अंत में क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल के साथ eluted. जब धोने के समाधान से अधिक ध्रुवीय trypsinized पेप्टाइड्स के एमएस के साथ युग्मित, इस विधि दोनों लिपोप्रोटीन की पहचान करने की क्षमता प्रदान करता है और एक ही प्रयोग में अपने N-टर्मिनस की विशेषता । जानबूझकर सोडियम adduct गठन भी एक उपकरण के रूप में नियोजित किया जा सकता है और अधिक संरचनात्मक जानकारीपूर्ण विखंडन स्पेक्ट्रा को बढ़ावा देने के । अंततः, लिपो और उनके एन के निर्धारण के संवर्धन-टर्मिनल संरचनाओं बैक्टीरिया प्रोटीन के इस सर्वव्यापी वर्ग पर और अधिक व्यापक अध्ययन की अनुमति होगी ।
Introduction
बैक्टीरियल लिपो एक संरक्षित एन-टर्मिनल लिपिड संशोधित cysteine है कि गोलाकार प्रोटीन डोमेन कोशिका झिल्ली सतह के लिए लंगर की विशेषता है । वे सार्वभौमिक बैक्टीरिया में वितरित कर रहे हैं, एक ठेठ जीनोम1के भीतर सभी सेलुलर जीन के 2 से 5% का गठन । लिपो सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, पोषक तत्वों की देखभाल, संकेत transduction, प्रोटीन परिसरों के विधानसभा, और सेल लिफाफा संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में2. रोगजनक बैक्टीरिया में, लिपो डाह कारकों3,4के रूप में सेवा करते हैं । एक संक्रमण के दौरान, एन टर्मिनल lipopeptides की मांयता टोल की तरह रिसेप्टर (TLR) 2 एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए हमलावर रोगजनकों को हटाने के लिए । एन टर्मिनल acylation राज्य के आधार पर, लिपो आम तौर पर वैकल्पिक TLR2 heterodimeric परिसरों द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं । TLR2-TLR1 पहचानता N-acylated lipopeptides, जबकि TLR2-TLR6 बाँधता इव lipopeptide α-एमिनो टर्मिनी. एक बार बाध्य, संकेतन रास्ते में भड़काऊ साइटोकिंस3,4के स्राव प्रेरित करने के लिए एकाग्र ।
यह पहले सोचा था कि ग्राम से लिपो-सकारात्मक बैक्टीरिया diacylated थे और ग्राम से उन नकारात्मक बैक्टीरिया triacylated थे, के अभाव या संरक्षण एन टर्मिनल cysteine अवशेषों पर एक के बीच जुड़े फैटी एसिड की उपस्थिति में भिंन । यह धारणा Lnt को ग्राम-धनात्मक जीनोम में अनुक्रम orthologs की कमी का समर्थन कर रही थी, चना-निगेटिव एन-acyl ट्रांस्फ़्रेज़ कि रूपों triacylated लिपो५. हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है ग्राम में लिपोप्रोटीन triacylation-सकारात्मक Firmicutes कि कमी lnt, साथ ही साथ तीन उपंयास एन टर्मिनल लिपोप्रोटीन संरचनाओं, peptidyl, lyso, और N-एसिटाइल फार्म6,7 ,8. इन निष्कर्षों संभव अभी तक के बारे में सवाल उठाने के लिए-होना-लिपोप्रोटीन रूपों की खोज की, कैसे इन उपंयास लिपो बना रहे है और क्या शारीरिक प्रयोजन या लाभ विभिंन रूपों प्रदान के बारे में बुनियादी सवालों के साथ । इसके अलावा, वे स्पष्ट रूप से जीनोमिक्स की वर्तमान अक्षमता को प्रदर्शित करने के लिए लिपोप्रोटीन संरचना की भविष्यवाणी । दरअसल, हम हाल ही में लिपोप्रोटीन एन के एक उपंयास वर्ग की पहचान-acyl transferases, बुलाया जलाया, से Enterococcus faecalis और बैसिलस cereus कि बनाता है lyso-form लिपो9। यह प्रयोग लिपोप्रोटीन संरचना, जो उनके अत्यंत hydrophobic प्रकृति और सीमित करने के लिए अपने आणविक संरचना विशेषताएं उपलब्ध तरीकों के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है सत्यापित करने की आवश्यकता इंगित करता है ।
के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिपोप्रोटीन प्रेरण पर अध्ययन की सुविधा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एन टर्मिनल संरचनात्मक दृढ़ संकल्प, हम कई पहले अनुकूलित किया है क्रम में जीवाणु लिपो को शुद्ध और एन-टर्मिनल तैयार करने के लिए tryptic lipopeptides विश्लेषण के लिए मालदी-तोफ MS6,10,11,12. लिपो एक की स्थापना की ट्राइटन X-११४ का उपयोग कर समृद्ध कर रहे है (इसके बाद surfactant या TX-११४) चरण विभाजन विधि, अनुकूलन के साथ के रूप में संदर्भित करने के लिए दूषित गैर लिपो और वृद्धि लिपोप्रोटीन उपज को दूर । इन लिपो TLR परख में प्रत्यक्ष उपयोग के लिए या एसडीएस द्वारा आगे की शुद्धि के लिए उपयुक्त है-पृष्ठ । मालदी के लिए-तोफ एमएस, nitrocellulose झिल्ली को लिपो के हस्तांतरण सीटू trypsin पाचन में कुशल के लिए एक पाड़ प्रदान करता है, धोने, और झिल्ली की सतह से बाद के रेफरेंस, अत्यधिक शुद्ध एन टर्मिनल lipopeptides में जिसके परिणामस्वरूप. Nitrocellulose नमूना हैंडलिंग की सुविधा के लिए दिखाया गया है और अभिंन झिल्ली प्रोटीन से अत्यधिक hydrophobic पेप्टाइड्स के लिए अनुक्रम कवरेज में सुधार13,14, साथ ही लिपो9,10 . विधि फ्रैक् पेप्टाइड्स के ध्रुवीकरण के आधार पर अतिरिक्त लाभ है, तो यह है कि मध्यवर्ती धोने समाधान उच्च विश्वास प्रोटीन पहचान के लिए एक साथ एन टर्मिनल संरचनात्मक दृढ़ संकल्प के साथ एक एकल प्रयोग में विश्लेषण किया जा सकता . इस प्रोटोकॉल विशिष्ट जानबूझकर सोडियम adduct गठन सुविधाएं एमएस के दौरान dehydroalanyl आयनों की ओर जनक आयन विखंडन को बढ़ावा देने के लिए/ms, N-acylation राज्य के संरचनात्मक असाइनमेंट में सहायता । N-टर्मिनस दोनों लिपो की TLR मान्यता से संबंधित सबसे चर और प्रमुख विशेषता है । एक साथ ले लिया, इस प्रोटोकॉल लिपो पर गहन और reproducible अध्ययन की अनुमति दी है, मालदी द्वारा शुद्धि और संरचनात्मक संकल्प के व्यक्तिगत चरणों के साथ-तोफ एमएस आसानी से प्रयोग के समग्र लक्ष्य के आधार पर अनुकूलित.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ प्रोटोकॉल लिपोप्रोटीन लक्षण वर्णन के दो अलग चरणों: TX द्वारा संवर्धन-११४ चरण विभाजन और संरचनात्मक संकल्प द्वारा मालदी-तोफ MS. TX-११४ निष्कर्षण के दौरान, अतिरिक्त केंद्रापसारक इस प्रक्रिया के…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
मेरेडिथ लैब में अनुसंधान स्टार्टअप Eberly विज्ञान कॉलेज (पेंसिल्वेनिया राज्य विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की निधियों द्वारा समर्थित किया गया था । हम पेन स्टेट प्रोटियोमिक् और मास स्पेक्ट्रोमेट्री कोर सुविधा, यूनिवर्सिटी पार्क, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, जहां जन spectrometric विश्लेषण प्रदर्शन किया गया में उपकरणों के लिए विशेषज्ञ तकनीकी सलाह और उपयोग के लिए Dr. तातियाना Laremore धन्यवाद ।
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
Riferimenti
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