Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Summary

Ein standard Western Blot-Protokoll wurde für die Analyse möglichst wenige 500 Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen optimiert. Optimierung beinhaltet sorgfältige Handhabung von die Zellprobe, Begrenzung der Transfers zwischen Röhren und direkt Lyse der Zellen im Probenpuffer Laemmli.

Abstract

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selten, mit der Maus Knochenmark enthält nur ~ 25.000 phänotypischen lange term repopulating HSCs. Ein Western Blot Protokoll wurde optimiert und eignet sich für die Analyse einer kleinen Zahl von Hsz (500-15.000 Zellen). Phänotypische HSCs wurden gereinigt, genau gezählt und direkt in Laemmli Probenpuffer lysiert. Lysates mit gleicher Anzahl von Zellen analysiert wurden durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE), und der Fleck war vorbereitet und nach standard Western Blot-Protokolle bearbeitet. Mithilfe dieses Protokolls 2.000-5.000 HSCs routinemäßig analysiert werden können, und in einigen Fällen Daten erhalten Sie von nur 500 Zellen, im Vergleich zu den 20.000 bis 40.000 Zellen in den meisten Publikationen berichtet. Dieses Protokoll sollte generell für andere hämatopoetischen Zellen, und ermöglicht die routinemäßige Analyse einer kleinen Zahl von Zellen unter Verwendung von standard-Labor-Verfahren.

Introduction

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selbst erneuernde Zellen, die zu allen Blut Linien führen können. Sie sind relativ seltene Zellen im Knochenmark, biochemische Analysen schwierig zu rendern. Geeignet für die Analyse von seltenen Zellen, wie Durchflusszytometrie, Ansätze wurden äußerst nützlich zur Quantifizierung der relativer Mengen der Zelle oberflächenmarker und intrazelluläre Proteine. Aber die Analyse von intrazellulären Proteinen erfordert den Einsatz von Zelle Permeabilisierung Verfahren zur Antikörper-Zugriff zu ermöglichen, und nicht alle Zelle Oberfläche Epitope überleben diese Verfahren^1,2. Darüber hinaus Antikörper, die Unterscheidung zwischen verschiedenen Isoformen oder das Dekolleté Proteinprodukte sind oft nicht für Durchflusszytometrie zur Verfügung, und daher die Ermittler noch setzen auf Western Blots für bestimmte Arten von Analysen.

Western-Blot Analyse der Zelle Lysates ist ein Routineverfahren in den meisten Labors. Zellen können unter heimischen Bedingungen, die die Epitope der Zelle Oberfläche Moleküle zu bewahren gereinigt werden, und anschließend Zelle Lysates vorbereitet und analysiert werden können. Jedoch kann die Analyse von Proteinen in seltenen Primärzelle, die Populationen von Western blot erforderlich euthanizing große Zahl von Tieren genügend Zellen zu erhalten. Durch kleine Anpassungen in mehreren Schritten, konnte einen konventionellen westlichen befleckenden Protokoll Proteine in relativ kleinen Stückzahlen HSCs (500-15.000, abhängig von dem Protein des Interesses) zu erkennen. Die Anpassungen beinhalten genau zählen der Zellen, Umgang mit sorgfältig die Zelle Pellet, Reduzierung der Übertragung von Zellen zwischen Rohren Zellverlust, zu minimieren und Lyse einer definierten Anzahl von Zellen mit einer konzentrierten Belastung mit Proteasom Puffern und Phosphatase-Inhibitoren. Viele veröffentlichten Berichte enthalten Western Blots erhalten mit 20.000 oder mehr HSCs^3,4,5,6,7; Dieses einfache Verfahren reduziert die Anzahl der Zellen und Versuchstiere erforderlich, um entsprechende Daten von zwischen 4 und 40 Falte zu produzieren. Das Protokoll soll Ergebnisse pro Zelle und nicht um eine interne Kontrolle zu normalisieren. Dies ermöglicht eine Erfassung der allgemeine Rückgang der Protein-Ebene, die übersehen werden können, wenn Daten in eine interne Kontrolle normalisiert werden. Die Bedeutung der Normalisierung auf einer Basis pro Zelle wurde für die Analyse von Gen Ausdruck Daten⁸beschrieben, und das gleiche Prinzip gilt für die Quantifizierung der Proteine durch Western-Blot. Dieses optimierte Protokoll sollte nützlich für alle, die zu geringe Anzahl Zellen analysieren.

Protocol

Alle Verfahren müssen im Einklang mit institutionellen Tiernutzung und Pflege-Richtlinien durchgeführt werden. Das Verfahren wurde entwickelt für die Analyse von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSCs und HPs), aber für die Analyse von anderen Zellpopulationen angepasst werden kann. 1. Flow Cytometry Isolation der murinen HSCs und HPs Murine Knochenmarkzellen zu ernten, wie in der Literatur6beschrieben.Hinweis: In die in <strong cl…

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse von 500-2.000 gereinigten HSCs und HPs sind in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt. Das β-Aktin-Signal in Abbildung 1 kann aus so wenig wie 500 HSCs erkannt werden und HPs gereinigt aus dem Knochenmark von einem einzigen Mausklick. Beachten Sie, dass die Lysates in 1,5 mm Brunnen laden ein viel stärkeres Signal von 500 HPs als laden in 3,0 mm Brunnen produziert. <strong cl…

Discussion

Western Blot ist ein verbreitetes Verfahren zur Erkennung von spezifischen Proteinen und die Aktivierung der Signalwege in Geweben oder Zellen. Durch die Einführung von kleinen Anpassungen zu einem häufig verwendeten Verfahren, konnten wir routinemäßig 15 verschiedene Proteine (Table of Materials) in 15.000 HSCs und in einigen Fällen in so wenig wie 500 HSCs erkennen. The Most wichtige Schritte in diesem Protokoll sind: (1) genau zählen die Zellen, 2) minimieren die Anzahl der Transfers zwischen R?…

Materials

sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis