白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

Summary

この原稿は、トランスジェニック レポーター マウスの使用は、アンジオテンシン II による高血圧は血管の生体顕微鏡を使用して免疫細胞の活性化を評価する蛍光色素の異なる投与経路について説明しますと、ロールし、内皮に付着する機能。

Abstract

落射蛍光生体ビデオ顕微鏡 (IVM) 血管は、免疫細胞の活性化と役割する能力を評価し、内皮層に付着する確立された方法です。循環し、蛍光色素や蛍光体結合抗体の注射によって細胞の可視化、使用されます。また、蛍光レポーター マウスを使用できます。特定リゾチーム M における白血球の相互作用⁺ (LysM⁺) 単球は、血管壁に血管機能不全や動脈高血圧を促進する上で極めて重要な役割を再生します。ここで視覚化し、白血球ローリングとアンジオテンシン II (AngII) 頚動脈で密着性を定量化する手法を提案する-マウス IVM の血圧。

カテーテルの注入は、血管壁を損傷、変更された血液細胞の反応に 。別の射出成形技術と LysMCre⁺IRG⁺で白血球を視覚化する投与経路を比較したマウスの赤色けい光たんぱく質の広範な表現とする LysM で緑の蛍光蛋白質の条件式⁺細胞。AngII 注入マウスを用いて LysM⁺細胞の活性化を研究、圧延および内皮に白血球の付着が増加します。我々 はどちらかアクリジン オレンジ、頚を使用してカテーテルを注入または直接尾静脈し、の量を比較しても圧延付着細胞と。わかった頸静脈カテーテル注入自体圧延の数が増加に付着する LysM⁺細胞偽注入 LysMCre⁺IRG⁺マウス コントロールと比較して.この活性化は、AngII 注入マウスの拡張だった。興味深いことに、アクリジン オレンジ直接尾静脈増加しなかった LysM⁺細胞接着を注入または偽注入マウスでローリングします。それによって、実験中に生体内のプロセスに干渉されていない蛍光蛋白質を表現する遺伝子改変レポーター マウスの重要性を示しました。さらに、蛍光トレーサーの尾静脈注射頸静脈カテーテル注射に可能な選択肢があります。

Introduction

動脈高血圧症は、心血管疾患と死亡のリスクを増加させるし、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、動脈または静脈の最も¹の開発を促進します。高血圧の開発は、環境、遺伝、内分泌、および血行力学的要因の相互作用に依存します。現在、高血圧²の病因に重要な役割を果たすには免疫と関連炎症も歓迎です。

T リンパ球、単球、マクロファージは免疫細胞の中で AngII 誘発血管炎症と高血圧、活性酸素種³をトリガーする能力に関連する部分で作因的に関与する見つかりました。大食細胞のコロニー刺激因子欠損のマウスは、血圧上昇や血管炎症⁴に関する AngII に還元反応を示した。前作、AngII 血圧⁵LysM + 単球の血管機能不全や炎症ドライブを見せてください。最近では、血小板とトロンビン依存性血管炎症⁶を誘発する血管壁が凝固第 XI 因子が協力して経路について述べる。高血圧症における免疫系の役割について現在のナレッジ最近要約されロドリゲス Iturbeらによって審査します。⁷

高血圧の開発に免疫細胞の関与が明らかになったのでモデルと容器と免疫細胞の相互作用を研究する手法が必要となった。血管の落射蛍光 IVM は循環血液細胞と内皮細胞^8,9,10の生体内での相互作用を観察する役に立つツールです。この手法により、dna (などアクリジン オレンジ) 間をインターカ レート染料の注入は、有核細胞 (循環と同様、内皮から) を視覚化できます。分離された血小板が前のヴィヴォローダミン 6 G のステンド グラスやジクロルフルオレッセン (DCF) を注入して、動脈または静脈の損傷モデルにおける血小板血栓を視覚化することができます。

頸静脈カテーテルのトレーサーを注入するために使用またはマークの通常、血小板。単球の活性化に効果があると、内皮の変化と凝固カスケードの後続活性化両方知られています。血管内皮細胞障害はすぐにその後単球の魅力と活性化¹¹組織をシールする内皮下マトリックス分子を介して血小板の活性化に します。それどころか、そのまま血管内皮細胞が抗凝固特性 (例えば、組織因子経路阻害剤またはトロンボモジュリン経由)¹²と単球などの分泌を直接抑制効果を持っている知られています。マイクロ Rna の¹³を含む細胞小胞。単球は組織因子、凝固カスケードのエクスプレス プロテアーゼ活性化受容体 (PARs) トロンビンによってアクティブにすることができ、単球活性化^{14,15 に参加する外因性活性剤を生成する知られています。}.したがって、任意の活性化血小板または血管損傷による血液凝固カスケードの可能性があります予期しない単球活性化に対する影響とみられる現象を妨げる。IRG トランスジェニック LysM Cre トランスジェニック マウス、二重蛍光 Cre レポーター マウス (LysMCre⁺IRG⁺) の助けを借りて、提案する LysM⁺のカテーテルでの代替方法で注射の効果の詳細に検討するには動脈高血圧症¹⁶マウス モデルにおける骨髄単球性細胞。

Protocol

雄マウスの年齢 8 ~ 12 週間ラインラント = プファルツ州 (承認番号 23 177-07/G12-1-002 と 23 177-07/G15-1-051) から動物実験に倫理委員会の承認の下で古い実験を行った。 1. マウスの麻酔や手術の準備 手術前に良好な健康状態と動物の状態を確認します。術前に体重、食糧や水の消費量だけでなく、全身状態 (外観、姿勢、自発的行動) の 2-3 日に一度動物を監視します。 腹腔内にミダゾラム (5 mg/kg 体重)、メデトミジン (0.5 mg/kg 体重)、フェンタニル (0.05 mg/kg 体重) と麻酔のマスターの組合せを準備 (i. p.) 26 G 針で 1 mL 注射器で 200 μ L/30 g マウスを注入します。 浸透圧ポンプ注入と IVM の実験のための動物の準備は、プラットフォームを温暖化 39 ° C と操作フィールドで実行されます。滅菌消毒風呂のすべてのツール、地球温暖化のプラットフォームを消毒してください。 手続き中に眼軟膏を動物の目を保護します。浸透圧ポンプ注入前にカミソリで毛を削除します。頸動脈と頸静脈カテーテルの注入を IVM 実験の隔離のための脱毛クリームと綿棒を使用します。2 つの皮膚の消毒剤を使用して動物の皮を消毒: 1 つの防腐剤と消毒剤のポビドン ヨードとの 1 つを含む皮膚アルコール ・ ベースのソリューションで防腐剤の含まれている octenidine。 麻酔 (「antisedan ミックス」) atipamezol (0.05 mg/kg 体重) とフルマゼニル (0.01 mg/kgbody 重量) を敵に回したマスター ミックスを調製し皮下に 26 G 針で 1 mL 注射器で 200 μ L/マウスを準備 (サウスカロライナ) 注入。 2. 浸透圧ポンプの準備と移植 注: 浸透圧のポンプを使用して皮下 AngII 注入によって記述されていた詳細に Luら17 滅菌生理食塩水の凍結乾燥粉末を再構成することによって、AngII を準備し、動物の重量とポンプの配信レートで濃度を調整します。プラスチック チューブ (ガラス管を使用していない) に再構成された AngII をしてください。 7 日間の 1 mg/(kg·d) を提供する AngII ソリューションでポンプを入力します。調製後ポンプを維持、4-6 時間滅菌生理食塩水で最低 37 ° C で リア混ぜ麻酔の注射は足の反射と温かみのある操作フィールド上に配置後は、マウスの完全な麻酔をテストします。麻酔導入は 10-15 分かかります、暗い環境で動物を配置している場合、良い作品します。 マウスの腰をそるし、アルコールの皮膚消毒と消毒します。 はさみを使って背骨に垂直な 1 cm の切開を行います。海峡の止血を使用してポンプのためのポケットを作成し、ポンプを挿入 (まず司会の流れ)。ポケット傷口に圧力がないとポンプの自由な移動を許可する必要があります。 炎症; を制限するために縫合糸、およびないクリップで傷を閉じる皮膚消毒剤で消毒します。 Antisedan ミックスを 200 μ l 添加の皮下注射による麻酔の反感を買う、そのケージにマウスを戻ります。 ブプレノルフィンによる術後鎮痛を行う (0.075 mg/kg 皮下) 動物の行動に応じてオンデマンド手術後 1 時間。 3. 頸静脈カテーテル注入と頸動脈の準備 麻酔の注射と後部食品反射を混ぜて位麻酔動物背 recumbence 39 ° C 手術板上軟膏をつけ、温度を維持するために直腸プローブを持つ後マウスの完全な麻酔をテストします。プロシージャの間にそれらを保護するために目。 首毛、脱毛クリームを使用してを削除します。普及し、毛が脱落する開始まで 2 分間クリームをこする綿棒を使用します。さらに 2 分後ヘラでクリームと毛を削除し、アルコールの皮膚消毒で皮膚を消毒します。 顕微鏡下で手術を行います。頸部、気管の横に 1 cm の縦皮膚で 1 〜 1.5 cm の切開を行います。最初の切開の両方の下肢を垂直に他の 2 つの切開を行います。 慎重に皮膚の横にある組織、左内頚静脈と気管を覆っている皮膚の部分を取り外します。 慎重に分離; 耳下腺2 カーブタイプ鉗子と利子のゾーンから舌下腺と顎下腺。カットにまたは損傷腺、頸静脈、頸動脈の最高アクセスを許可するようにそれらを配置しないでください。 頸静脈を分離するには、細い鉗子を使用して、ゆっくりと開き、クローズして周囲の組織から血管を優しく解放します。静脈が完全にきれいになったら容器の下に鉗子を配置し、それの下で 10 cm の 2 つの 7-0 縫合糸を配置します。 2 つの結び目の頭部に近位の縫合を閉じます。その他の縫合の 1 つの結び目を準備が終了しません。 37 ° C; 片手で鉗子を滅菌生理食塩水で満たされたカテーテル (0.61 mm 外径、内径 0.28 mm) を保持します。他の手で、薄いはさみや湾曲した 26 G 針で容器に小切開を確認します。その後、頚静脈にカテーテルを挿入し、2 回結び目を閉じます。完全な固定を確保するために、カテーテルの上頭の近位の縫合を閉じます。 特定し頚動脈を準備するには、区域を薄いカーブタイプ鉗子を使用して気管を解剖します。 頸動脈が周囲の組織から解放されたら、船から (それは頸動脈に隣接する白い線のように見える) 迷走神経を削除 (しかしそれをカットされません)。細い鉗子をクローズし、ゆっくりと優しく神経を動員して開くことができます。 両方の動脈が完全にクリーンな最初の頚動脈下鉗子を置き、船下小黒 3 mm 幅 x 2.5 cm の長さのプラスチック片を配置します。伸び過ぎて血管が血流が容器ホルダーが配置される存在であることを確認する非常に重要です。容器ホルダーに 2 つ目の動脈を置きます。顕微鏡下で直接マウスを挿入しない場合は気管上腺を戻すし、37 ° C ゾーンの乾燥を避けるために滅菌生理食塩水を適用します。 4. ローリングと白血球の付着の評価する LysM + セル IVM の/ アクリジン オレンジ 2 mg/mL 原液-20 ° C で保存からを準備し、それを 1 mL の注射器の滅菌生理食塩水 (最終濃度が 0.5 mg/mL) で 1:4 希釈します。注射器を光から保護し、マウスを一回あたり 200 μ L を使用します。 さまざまな条件をテスト: アクリジン オレンジ頸静脈カテーテル; (1) 注射((この状態で内頸静脈カテーテルが注入なし); 尾外側静脈に直接アクリジン オレンジの注入 2)(3) アクリジン オレンジ蛍光 LysMCre+IRG+を用いたマウス (ここは再び頸静脈カテーテルが注入なし) することがなく測定。 カテーテルは、場所と 2 つの頸動脈が分離、顕微鏡下でマウスを置きます。長距離コンデンサーと 10 X を使用して高速ワイド フィールド蛍光顕微鏡を用いた測定を行う (NA 0.3) 分光器、ビームスプリッター、電荷結合素子カメラと水浸対物レンズです。画像の獲得およびリアルタイム イメージング システムの分析を実行します。 血管内皮細胞表面で頸動脈の真ん中に対物レンズの焦点を合わせます。アクリジン オレンジの 50 μ L (0.5 mg/mL) (最初の注入用カテーテルのデッド ボリュームを考慮に入れなさい) をゆっくりと注入します。画像ごとに 120 ミリ秒の露光時間で 100 の画像を記録するソフトウェアを設定します。 各ビデオの動脈上の異なる場所で内頚動脈 (左と右) あたりの 4 つのビデオを作る。蛍光信号が小さくなる場合は、アクリジン オレンジの別の 50 μ L を挿入します。 すべてのビデオを記録した後頚部転位によって、動物を安楽死させます。 毎秒 10 枚で動画の速度を設定して各ビデオの容器の中央に置かれた 200 μ x 250 μ m 四角形ビューでローリングと付着性細胞を定量化します。ローリングと付着性のセルを数える;付着性のセルは、セルを移動しない、または 10 の s ビデオ内血管内皮細胞からデタッチとして定義されます。定量化を簡素化し、赤い蛍光を用いたチャネルを削除し、ローリングと付着細胞をカウントする緑の蛍光性を使用します。 アクリジン オレンジを用いた実験では、血管内皮細胞によって作られたバック グラウンドを除去するために蛍光性の手動によるしきい値を確認します。

Representative Results

頸動脈 LysMCre+IRG+の AngII で注入されたマウスは、IVM を用いて観察しました。アクリジン オレンジは、頸静脈カテーテルを用いた注入しました。(これは容器との相互作用細胞型の差別に開いている残ったので船との対話可能性がありますもすべての有核循環細胞と比較して血管壁との接触する LysM+細胞の割合を見てを目指しました私たちの以前の作品からの質問)。ベースラインで頸静脈カテーテルの存在する LysM+細胞 (図 2 aD) の付着が発生します。同じ細胞が蛍光、アクリジン オレンジ注射後がまた内皮細胞が蛍光 (図 2 b, E)。内皮を制限するバック グラウンドの低減は、蛍光関連後、データ示す核付着細胞はすべている LysM+ (図 2f)。私たちの以前の結果を確認して、LysMCre+IRG+が AngII の LysM+細胞の活性化に及ぼす影響を観察するためのよいモデルであることを示す AngII 注入後は、これらの結果が当てはまります。 アクリジン オレンジ LysMCre+IRG+で AngII 注入後 LysM+細胞の活性化での投与経路の役割を評価しました。AngII 輸液、白血球の血管内皮細胞の相互作用の 1 週間後 LysMCre+IRG+の頚動脈でマウスがイメージし、IVM アクリジン オレンジ インジェクション尾静脈、頸静脈カテーテルを介しての有無で可視化しました。カテーテルや注射、なし LysM+細胞の圧延有意に増加した後 AngII 注入未処理マウスと接着に比べて増加して (図 3)。アクリジン オレンジ増加頸静脈カテーテルの接着と AngII で圧延の注入は、カテーテル (図 3) なしのマウスと比較して大きい程度にマウスを扱われます。アクリジン オレンジの尾静脈内の注入とアクリジン オレンジ (図 3) の注入を受信しなかったマウスと比較する転がりと同様の接着になります。 図 1。アンジオテンシン II 注入する LysM+の評価方式セル圧延とマウスで接着。LysMCre+IRG+マウス 7 日わいて AngII とアクリジン オレンジの尾静脈、頸静脈カテーテルを通じて注入の有無 LysM+をローリングし同様に付着、頸動脈の細胞の定量を行ったインジェクション。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2。LysM+細胞接着、圧延 LysMCre+の頚動脈の IRG+マウスの査定。LysM 接着+細胞 LysMCre+の IRG+マウス (A, D) 前に、頸静脈カテーテル (B, E) アクリジン注入後。赤と緑の蛍光を記録した、(緑) の LysM+細胞と平滑筋細胞 (赤) で表示されています。アクリジン オレンジの注入後、内皮細胞でも緑色で表示されますが、背景の蛍光性を削除することによりセルの視覚化 (C, F) を核だけを循環します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3。アンジオテンシン II の蛍光色素の投与経路の評価は、IRG+マウス LysMCre+を注入しました。ローリング (A) と (B) LysM+を付着の定量細胞偽運営または AngII 注入動物と頸静脈カテーテルを用いたアクリジン オレンジの尾静脈注射による注入の有無。さまざまな条件 (C) の代表的な写真。結果は、平均の平均 ± 標準誤差です。2 ウェイ ANOVA を行った、ボンフェローニのホックを投稿テスト、n = 3-12/グループ;p < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

高血圧⁵の開発に関与する LysM⁺単球は以前示した。LysM⁺の免疫細胞がロールし、AngII 注入に応えて内皮層に準拠を示します。この発見は、LysMCre⁺IRG⁺を使用して得られたアクリジン オレンジ^6,10の注入と白血球の可視化による生体内で高血圧症における免疫細胞の役割を探る私たちの以前の研究からマウス。したがって、内皮に付着した細胞の種類の識別は不可能だった。

IVM は血管の検査や、血管に直接細胞の生体内観察の非常に便利なツールが、高血圧症の炎症性のコンテキストで外科的に挿入されたカテーテルの助けを借りて、染料を注入することの影響は不明のまま。カテーテルとアクリジン オレンジの潜在的な効果を評価する射出我々 は IRG⁺マウス LysMCre⁺の利点を取った。AngII 注入増加 LysM⁺細胞を血管内皮細胞に圧延の。頸静脈へのカテーテルの挿入増幅効果とカテーテル インプラントなしでマウスと比較されたカテーテルと計測 AngII 注入マウスよりローリングと付着した白血球が検出されました。これはその注入のコンテキストにおける全身性炎症反応は創傷治癒のオーバーレイされる高血圧¹⁸に見られる免疫反応を頸動脈カテーテル原因のことを示します。また、頸動脈、頸静脈の近接のため頚静脈に影響を与える追加免疫活性化を発生している可能性があります。この効果が直接に尾静脈注射が行われたとき存在していないので効果が期限であると仮定ことができます染料ではなく、カテーテルの挿入のプロシージャに。我々 は実験中に生体内のプロセスに干渉されていない蛍光蛋白質を表現する遺伝子改変レポーター マウスの重要性を示します。さらに、蛍光トレーサーの尾静脈注射頸静脈カテーテル注射に可能な選択肢があります。

プロシージャの 1 つの重要なステップは、AngII 注入です。ポンプによって血圧の尾カフ評価 AngII 配信の有効性を制御するために可能です。血圧は、注入の 2−3 日後増やす必要があります。炎症 LysM⁺細胞活性化に影響を及ぼす可能性を制限するには、ポンプが注入されて切開の閉鎖は、クリップではなく縫合すべきであります。1 つの制限は、尾静脈注射に関する注意されなければならない: 最高の可能なデータ収集をするためには、4 つのビデオ、通常各頸動脈の撮影します。蛍光信号が小さくなる、アクリジン オレンジの 50 μ L を注入が、尾の注入といくつかの注射をして、頸動脈を対物レンズの下で安定させるためにより困難です。頸静脈カテーテルの存在の期間かもしれない免疫細胞活性化を調節するもそれがカテーテル注入¹⁹後 4 h を作製した多血小板血漿の凝固活性化に影響を与えるので。カテーテル注入のこの側面はさらに調べる必要があります。

最後に、頸静脈カテーテル注入 AngII 注入後 LysM⁺細胞の活性化の影響を感謝して、たとえ完全には推定不可能で準備、皮膚の除去、および潜在的な LysM⁺セルに頸動脈の分離の役割活性化。ような蛍光レポーター マウスの使用を終えて LysMCre⁺IRG⁺マウス生体内イメージングのため動物の準備時に容器の完全性の混乱を避けるためにお勧めします。

Materials

Midazolam	Ratiopharm GmbH		Anesthesia mix
Medetomidine	Pfizer Deutschland GmbH		Anesthesia mix
Fentanyl	Janssen-Cilag GmbH		Anesthesia mix
Alzane	Zoetis		Antisedan mix
Flumazenil	Hikma pharma		Antisedan mix
Braunol	B Braun
Octeniderm	Schülke
Osmotic pumps	Alzet	1007D	Osmotic pump implantation
Angiotensin II	Sigma-Aldrich		Osmotic pump implantation
7-0 prolene suture	Ethicon		Osmotic pump implantation
Acridine orange	Sigma-Aldrich
Catheter	Smiths Medical Deutschland GmbH		Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm
Microscope	Olympus	BX51WI fluorescence microscope
Beam Splitter	Photometrics	CMR-DV2-SYS – DualView2 MicroImager
Objective	Olympus	UMPLFLN10X	Water immersion objective with a monochromator
Camera	Hamamatsu Photonics	ORCA-R2
Image acquisition and analysis software	Olympus	Realtime Imaging System eXcellence RT
Mice	The Jackson Laboratory	Jax 008705	B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J
Mice	The Jackson Laboratory	Jax 004781	LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )