JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Published: April 05, 2018
doi:
10.3791/56972
, , , , , , ,
1Department of Genomic Medicine,University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Abstract

Histon modifikasyonları epigenome önemli bir bileşeni oluşturur ve ilişkili loci transkripsiyon durumunu belirlemede önemli düzenleyici rol oynarlar. Buna ek olarak, belirli değişiklikler varlığı pozisyon ve kimlik arttırıcılar gibi kodlama-işlevsel öğeleri belirlemek için kullanılmıştır. Son yıllarda, sonraki nesil sıralama (ChIP-seq) tarafından takip Kromatin immunoprecipitation bireysel Histon değişiklikler genom çapında profilleri belirlemede güçlü bir araç haline gelmiştir. Ancak, Kromatin değişiklikler, Kromatin Birleşik anılacaktır Kombinatorik şekillerinin kimlik ve ilişkili genomik locus doğasını belirlemek giderek netlik kazanmıştır. Bu nedenle, bir dizi Histon değişiklik işaretleri yanı sıra hesaplama analizleri boru hatları yetenekli profil oluşturma için sağlam yüksek üretilen iş (HT) metodolojisi oluşan iş akışları ChIP-Seq onbinlerce işleme veri profil oluşturma, için gerekli epigenomic Birleşik Devletleri çok sayıda örnekleri kapsamlı belirlenmesi. Burada sunulan HT-ChIP-Seq iş akışı iki modülden oluşmaktadır: 1) tümör örnekleri ve hücre hatları bir 96-iyi biçimde; küçük miktarlarda birkaç Histon bazı değişiklikleri profil oluşturma için deneysel bir protokol ve 2) bireysel işareti doluluk ve Kombinatorik Kromatin devlet desenleri hesaplamak için varolan araçları birleştiren bir sayısal veri analiz boru hattı. Birlikte, bu iki modül ChIP-Seq örnekleri yüzlerce kolay hızlı ve verimli bir şekilde işleme kolaylaştırmak. Burada sunulan iş akışı 6 Histon Ilhan profilleri Melanom tümörler ve hücre satırlarını Kromatin devlet desenleri türetmek için kullanılır. Genel olarak, biz onlarca insan tümör örnekleri ve kanser hücre hatları çeşitli maligniteler epigenomic anomalileri belirlemek için uygulanabilir kapsamlı bir çip seq iş akışı mevcut.

Introduction

Memeli genleri (98-%99) çoğunluğu kodlamayan dizisi oluşmaktadır ve bu nocoding bölgeler gen ekspresyonu ve Kromatin kuruluş1,2kontrolünde katılmak için bilinen yasal öğesinde yer. Normal bir hücrede, sıkıştırılmış Kromatin yapısı belirli derlemeye genomik DNA’ın mekansal organizasyon, düzenleme ve çeşitli DNA ilişkili işlemler3,4,5hassas zamanlama için önemlidir. Bir kanser hücresi ancak, Kromatin değişiklikler anormal epigenetik mekanizmalar tarafından uygun olmayan düzenleyici elemanlarının, kromozom döngü sistemleri ve gen ifade desenleri6erişim dahil olmak üzere Kromatin yapısı, organizasyonu yol açabilir, 7,8,9,10.

Son gelişmeler rağmen biz anlayış tümör ilerlemeyi veya terapötik yanıt ile ilişkili epigenetik değişiklikler sınırlıdır. Epigenome değişiklikler, Histon izleri ve DNA metilasyonu, topluca gen ifade ağları ve diğer işlemler korumak için kritik önem üzerine gelmesi (Kromatin devlet olarak adlandırılır) dinamik bir devlet oluşturmak da dahil olmak üzere bir dizi oluşur hücresel kimlik. Son zamanlarda, değişiklikler arttırıcılar içinde birden çok maligniteler H3K27Ac profilleri11inceleyerek gösterilmiştir. Bu tür çalışmalar izole epigenetik işaretleri korelasyon içgörü sağlamak rağmen 100’den fazla epigenetik değişiklikler belirlenen12,13 biyolojik rolleri net anlayış olmadan edilmiştir ve karşılıklı bağımlılık. Ayrıca, orada bu Histon ve DNA değişiklikler olası Kombinatorik desenleri daha büyük bir dizi ve epigenetik Birleşik14dikte bu Kombinatorik kalıpları – değil tek tek değişiklikleri – öyle. Bu nedenle, kanser ilerleme ya da terapi. yanıt sırasında değişiklikler bu Kromatin Birleşik Devletleri tanımlamak için muazzam gerek yoktur Kapsamlı bilgi epigenome değişikliklerini kanserleri ahşap kaplama kısmen teknik (örneğin klinik malzeme/tek hücreleri küçük bir miktar büyük ölçekli veri üretme) nedeniyle ve analitik (tanımlamak içinörneğin algoritmaları Kombinatorik Birleşik) Zorluklar. Bu nedenle, çok kritik ihtiyaç Histon değişiklik işaretleri klinik malzeme ve uygulamak kolay Hesaplamalı yaklaşımlar çok sayıda profil oluşturma için sağlam yüksek üretilen iş yöntemleri için kolaylaştıracaktır Kombinatorik desenleri tahmin etmek tumorigenesis ve tedavi direnci farklı aşamalarında ile ilişkili epigenetik Birleşik belirlenmesi. Ayrıca, veriler son epigenome profil oluşturma çalışmaları15,16,17,18,19,20,21, 22,23 normal dokuların ve hücre satırlarını Kromatin profilleri daha da epigenome katkı tümör biyolojisi anlayışlar için tümörlerin ile entegre olabilir.

Kromatin profil oluşturma çeşitli Kromatin değişiklikler15,24küresel bağlama kalıpları tanımlamak için güçlü bir araç haline gelmiştir. Son yıllarda, ChIP-seq “altın DNA-protein etkileşimler bir küresel ölçekte25,26,27üzerinde çalışmak için standart” haline gelmiştir. Herhangi bir çip seq deneme için doku işleme ve ayırma dahil, en uygun sonication koşulları, yağış, Kütüphane hazırlık için en uygun antikor yoğunlaşması belirleneceği belirleneceği, başarı için gerekli kritik adımlar vardır, veri işleme ve aşağı akım analiz sonrası sıralanıyor. Bu adımların her biri, anahtar kalite kontrol denetim noktaları içeren ve birlikte alındığında düzgün işlev doğrulama için olası hedefler belirlemek için önemlidir. Bu adımda yenilik metodolojileri ChIP veya çip Seq doku28,29,30,31,32 az miktarda gerçekleştirmek için çeşitli önceki çalışmalarda geliştirdik . Ayrıca, bazı çalışmalarda yüksek işlem hacmi ChIP deneyler PCR tarafından takip protokollerde Nefelometri33,34dayalı düşündürmektedir. Son olarak, bazı yayım kullanılabilir analiz platformlar ChIP-Seq veri için şimdi Easeq35 ve Galaxy36gibi kullanılabilir. Ancak, tek işareti ve Kromatin devlet analizleri gerçekleştirmek için sayısal bir boru hattı ile birlikte yüksek üretilen iş moda ChIP-Seq gerçekleştirmek için entegre bir platform eksik edilmiştir.

Bu iletişim kuralı tümör doku ve hücre hatları, Kromatin durumlarda genom geniş eşleme için bir tam ve çok yönlü ChIP-seq iş akışı ile kolay başarılı bir deneme için gerekli adımların tümünü kapsayan yönergeleri yerine getirmeniz açıklar. Daha önce Blecher-Gönen vd tarafından açıklanan bir yüksek-den geçerek yöntemi benimseyerek 37, bu protokolü örnekleri paralel onlarca üzerinde gerçekleştirilen ve kanser hücre satırları ve Melanom, kolon, prostat ve glioblastoma multiforme gibi insan tümörlerin başarıyla uygulandı. Biz insan melanoma hücre satırları ve tümör örnekleri epigenetik düzenleyici peyzaj anahtar bileşenlerini temsil eden altı çekirdekli Histon değişiklikler için metodoloji göstermek. Bu değişiklikler H3K27ac içerir (arttırıcılar), H3K4me1 (aktif ve hazır arttırıcılar), H3K4me3 (Organizatör), H3K79me2 (transkripsiyonu bölgeler), H3K27me3 (polycomb baskı) ve H3K9me3 (heterochromatic baskı). Bu işaretler baskıcı ve etkin etki alanları temsil eden işlevsel olarak farklı Kromatin Birleşik tanımlamak için tek başına veya birlikte kullanılabilir.

Protocol

Tüm klinik örneklerin Kurumsal değerlendirme Komitesi yönergeleri izleyerek elde edilmiştir. 1. arabellek hazırlık TE arabellek (10 mM Tris-HCl, 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 8.0) 200 mL olun. STE arabellek (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl) 200 mL olun. 2,0 M glisin (200 mL su glisin 37.52 g) 200 mL olun ve 65 ° c ısı 200 mL % 5 sodyum deoxycholate (DOC) çözeltisi (200 mL su içinde doktor 10 g) olun. <l…

Representative Results

Bu iletişim kuralı donmuş tümör doku ve bir yüksek-den geçerek yöntemi (resim 1A)kullanarak paralel örnekleri onlarca üzerinde gerçekleştirilen hücre satırlarından immunoprecipitation sağlar. Kromatin parçaları ~ 200-1000 bps için en uygun immunoprecipitation arasındaki mesafe. Biz aynı kesme uzunluğu ulaşmak için gereken süreyi farklı doku ve hücre tipleri için farklı gözlemlemekteyiz. Küçük parça–dan az mi…

Discussion

Bu iletişim kuralı genom geniş eşleme Kromatin durumlarda insan tümör doku ve hücre hatları için tam ve çok yönlü yüksek işlem hacmi ChIP-seq modülü açıklar. Herhangi bir çip seq protokolünde antikor özgüllük en önemli adımlardan biridir. Burada, immunoprecipitation koşullar tüm bunların ChIP-Grade ve daha önce bizim diğer laboratuvarlar42,44,ve45 doğrulanmış açıklanan altı Histon değişiklik…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Marcus Coyle, Curtis Gumbs, MDACC SMF özünde sıralama destek için teşekkür ediyoruz. Bu makalede açıklanan çalışma NIH grant (CA016672) dan gelen hibe için SMF çekirdek tarafından desteklenen ve ncı K. R. (1K99CA160578 ve R00CA160578) Ödülleri

Materials

ChIP-grade H3K4me1 antibody Abcam ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody Abcam ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody Abcam ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody Abcam ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody Abcam ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody Abcam ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0 Teknova T1080
EDTA Sigma-Aldrich E9884
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
DPBS Sigma – Life Sciences D8537-500ML
SDS Sigma-Aldrich 74255
Triton-X Sigma-Aldrich X100-100ML
LiCl Sigma-Aldrich 746460
NP-40 Calbiochem 492016-100ML
1% TWEEN-20 Fisher Bioreagents BP337-500
BSA – IgG-free Sigma – Life Sciences A2058-5G
HBSS Gibo 14025092
GentleMACS C tube GentleMACS 120-008-466 disassociation tube
16% Formaldehyde Peierce 28906
miniProtease inhibitor  Roche Diagnostics 11836153001 protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G  Invitrogen 10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL Diagenode C30010011 sonication tubes
DynaMag – 96 Side Skirted Invitrogen 120.27 96-well magnetic stand
TE buffer Promega V6231
RNase A Invitrogen 12091021
Proteinase K Invitrogen 100005393
AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 paramagnetic beads
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit New England BioLabs E7645L DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water Ambion AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584 high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents Agilent Technologies 5067-5585 high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) New England BioLabs E7335L Multiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) New England BioLabs E7500L Multiplex Oligos 
TapeStation 4200 Agilent Technologies G2991AA high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device  Diagenode B01060001 water bath disruputor
Mixer Nutator 421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196 PCR Thermal cycler
Water Bath Fisher Scientific 2322
Multichannel Pipet Denville 1003123
Tube Revolver Thermo-Scientific 88881001
96-Well Skirted Plate Eppendorf 47744-110
Allegra X-12R Centrifuge  Beckman Coulter A99464 benchtop centrifuge
Centrifuge 5424 Eppendorf 22620461 tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip) Agilent Technologies 401428
Optical tube strip caps (8x strip) Agilent Technologies 401425
Loading Tips, 10 Pk Agilent Technologies 5067-5599
IKA MS3 vortex IKA 3617000 vortex
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O’Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake–a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Tags

Chromatin StatesChIP-sequencingCancer EpigeneticsHistone ModificationsChromatin FragmentsHistone AntibodiesProtein G Magnetic BeadsChIP Dilution Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Terranova, C., Tang, M., Orouji, E., Maitituoheti, M., Raman, A., Amin, S., Liu, Z., Rai, K. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. J. Vis. Exp. (134), e56972, doi:10.3791/56972 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image