اختبار في نموذج ثقافة خلية 3D على أساس كروي للرأس والرقبة الحرشفية خلية العلاج
Summary
ونحن تصف تطور نموذج كروي، ثلاثي الأبعاد في المختبر التي تمكننا من اختبار المعيار الحالي لنظم العلاج التجريبي للرأس والعنق الخلايا الحرشفية في خطوط الخلايا، تهدف إلى تقييم العلاج قابلية والمقاومة على الخلايا الأولية من العينات البشرية في المستقبل.
Abstract
خيارات العلاج الحالية للرأس المتكررة والمتقدمة والرقبة الخلايا الحرشفية (HNSCC) أرفق الإشعاع والكيماوي-الإشعاع النهج مع أو بدون عملية جراحية. في حين نظم العلاج الكيميائي على أساس البلاتين حاليا تمثل معيار الذهب من حيث الفعالية، وترد في الغالبية العظمى من الحالات، نظم العلاج الكيميائي الجديدة، إلا وهي العلاج المناعي آخذة في الظهور. ومع ذلك، معدلات الاستجابة والعلاج آليات المقاومة لنظام العلاج الكيماوي أما يصعب التنبؤ وتظل مفهومة غير كاف. اختلافات واسعة من آليات المقاومة الكيماوي والإشعاع معروفة حتى الآن. تصف هذه الدراسة وضع مقايسة موحدة، والفائق في المختبر لتقييم الاستجابة HNSCC الخلية خط لمختلف الأنظمة العلاجية العلاج، ونأمل في الخلايا الأولية من المرضى الفردية كأداة مستقبل للورم شخصية العلاج. المقايسة صمم لإدماجها في خوارزمية مقياس مراقبة الجودة للمرضى هنسكك في مركز الرعاية الثالثية بنا؛ ومع ذلك، سيكون هذا موضوع دراسات المستقبلية. الجدوى التقنية تبدو واعدة للخلايا الأولية من ورم الخزعات من المرضى الفعلية. ثم يتم نقل العينات إلى المختبر. يتم فصل خزعات ميكانيكيا متبوعاً بالهضم الأنزيمي. ثم تستزرع خلايا في قنينات الثقافة خلية التصاق منخفضة للغاية التي تروج لتشكيل تكتلات خلية ثلاثية الأبعاد، على شكل كروي استنساخه وموحدة وعفوية. ثم الماغنيسيوم على استعداد للتعرض للإشعاع الكيماوي البروتوكولات وبروتوكولات العلاج المناعي حسب الحاجة. حجم الخلية النهائية على البقاء وكروي مؤشرات قابلية العلاج ويمكن استخلاص ذلك في الاعتبار في المستقبل لتقييم استجابة المرضى العلاج المحتمل. هذا النموذج يمكن أن يكون أداة قيمة وفعالة من حيث التكلفة نحو شخصية علاج سرطان الرأس والرقبة.
Introduction
الرأس والعنق الخلايا الحرشفية (HNSCC) هو سادس أكثر أنواع السرطان شيوعاً في جميع أنحاء العالم مع حدوث ارتفاع المرضية المرتبطة بالإصابة المخاطية فيروس الورم الحليمي البشري (فيروس الورم الحليمي البشري)، إلى جانب غالبية الحالات الناجمة عن إفراط النيكوتين والكحول الاستهلاك 1،2. بينما عادة علاجها جيدا مع الاستئصال الجراحي، عادة جنبا إلى جنب مع تشريح العقدة الليمفاوية عنق الرحم، أورام أصغر ومراحل ما قبل الغازية علاج هنسكك مرحلة متقدمة والمتكررة لا تزال صعبة بسبب غزو الورم العدوانية مع انتشار المنتشر والمقاومة للإشعاع والعلاج الكيميائي البروتوكولات3،4،،من56،،من78. تشير الدراسات الأخيرة إلى تقلب عالية من النمط الظاهري الخلوية، وتوصيف الفرعية المتمثلة في تعميم ونشر ورم الخلايا قد بدأت للتو9،10. اعتقاد سابق من ورم صلبة وموحدة قد الجماهيري المزمع تنقيحها في ضوء الدراسات التي أجريت مؤخرا في الماضي سنوات11،،من1213،14. النهج الحالي لتوصيف الورم وتحديد الطفرات الرئيسية يمكن تحديد عدد الجينات التي يبدو أنها مرتبطة بمقاومة العلاج، لكنه يظل نهجاً باهظة التكلفة. وعلاوة على ذلك، لا تسمح معرفة التركيب الوراثي تنبؤ موثوق بها من النمط الظاهري وردها العلاج بالضرورة.
وهناك بعض التقدم في تحسين البقاء على قيد الحياة عموما وخالية من الأمراض للمرض مرحلة متقدمة والمتكررة. للنيكوتين-فضلا عن سرطان المرتبطة بالفيروس، أرفق خيارات العلاج الحالية إلى جانب الجراحة الإشعاعية العدوانية ونظم العلاج الكيميائي على أساس البلاتين. وكانت هناك آثار بالنسبة لمعدلات استجابة مختلفة بين سرطان فيروس الورم الحليمي البشري-السلبية والإيجابية؛ ولكن هذا لم يؤدي إلى تغيير وجه عام المبادئ التوجيهية للعلاج. المقاومة تجاه الإشعاع والعلاج الكيميائي هو ظاهرة واسعة انتشار في جميع مراحل الورم ويوجد للبلاتين–على أساس العلاج الكيميائي كذلك أما بالنسبة للعلاج المستهدفة (مكافحة-EGFR؛ مستقبلات عامل نمو البشرة) ومؤخرا بدأت تظهر نقطة تفتيش تثبيط15. يأتي الإشعاع غير فعالة والعلاج الكيميائي بتكلفة عالية كبيرة الاعتلال المرضى من حيث خطر انخفاض وظيفة الكلي أو القلب بينها عسر البلع وجفاف الفم والتهاب الغشاء المخاطي. التنبؤ باستجابة العلاج قبل قرار مفهوم العلاج العام لكل مريض على حدة ويبدو أن الهدف الحاسم، ومنع مفاهيم العلاج لا لزوم لها، والآثار الجانبية والتكاليف.
لقد سعينا إلى إقامة نموذج لاختبار قابلية المعالجة الفردية للمريض نحو الحالية الكيماوي-الإشعاع القياسية التي يمكن إدماجها في الخوارزمية علاج الأورام العادية ومراقبة الجودة من وجهة نظر تقنية دائمة. وكان الهدف الأقصى لاستخدام النموذج دون استخدام خطوط الخلايا المتغيرة بشكل كبير والذين تتراوح أعمارهم بين، كما أنها تمثل ضعف الخلايا السرطانية البشرية الفعلية دون تغيرها وعدم التجانس كما نعلم الآن، أثناء إنشاء بروتوكول جرى في مختلف خطوط الخلايا. أن تكون مستقلة فقط من خطوط الخلايا المتوفرة تجارياً، نحن مؤخرا بنجاح إنشاء خط خلية وسيطة تسمى “البيكا” من الخلايا هنسكك الأولية من عينات الأورام البشرية مع علامات الخلوية يحافظ على الممرات السطحية والمحدودة 16. ينبغي خط الخلية “بيكا هذا” بمثابة تمهيدا لوضع نموذج على الطريق إلى ثم في وقت لاحق عقب محاكمات مع الخلايا السرطانية البشرية الطازجة من ورم الخزعات. وقد ثبت أن الخلايا في خلية ثلاثية الأبعاد تتفاعل الثقافات بشكل مختلف وأكثر في فيفو-تود إدارة عقاقير مضادة للسرطان من تلك التي تنمو في مونولاييرس17،،من1819،20 ،21، أساسا بسبب الحفاظ على الهجرة والتمايز الفرعية خصائص معينة خلية فرعية22،،من2324. هنا، يمكننا وصف البروتوكول لنموذج ثلاثي الأبعاد على أساس كروي من خطوط الخلايا الوسيطة والخلايا الأولية الخلايا الحرشفية البشرية وطرق كيفية دمج هذا نموذج في علاج سرطان الرأس والرقبة الجراح والأورام ( الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
كنا قادرين على وضع بروتوكول لإنشاء الماغنيسيوم استنساخه من خلية المعلقات، لكلا خطوط الخلايا، وفي التجارب الأولية، والخلايا السرطانية البشرية الأساسية. أولاً نحن تقييم اثنين من الأساليب المذكورة سابقا، وحددت العلا-الأسلوب، أسلوب حيث يتم استخدام ألواح الثقافة مع الأسطح التصاق منخفضة لل?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان تمويل هذا المشروع بمنحه من جامعة ميونيخ (مشروع FöFoLe–رقم: 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
Riferimenti
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters’ significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies?. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
