Native Chromatin Immunopräzipitation mit Murine Gehirn Tumor Neurosphären
Summary
Epigenetische Mechanismen werden häufig in Gliom verändert. Chromatin Immunopräzipitation könnte verwendet werden, um die Auswirkungen der genetischen Veränderungen, die in Gliom zu studieren, die aus Änderungen in Histon Änderungen ergeben, die Chromatin Struktur und gen-Transkription regulieren. Dieses Protokoll beschreibt native Chromatin Immunopräzipitation auf murine Gehirn Tumor Neurosphären.
Abstract
Epigenetische Veränderungen können in der Entstehung und Progression von Gliom beteiligt sein. Veränderungen in der Methylierung und Acetylierung von Promotoren und regulatorischen Regionen der Onkogene und Tumor-Suppressoren können führen zu Veränderungen in der Genexpression und spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Hirntumoren. Native Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine populäre Technik, die erlaubt die Erkennung von Änderungen oder andere Proteine fest an DNA gebunden. Im Gegensatz zu vernetzten ChIP in native ChIP sind Zellen nicht mit Formaldehyd Protein kovalent an DNA Verbindung behandelt. Dies ist vorteilhaft, weil manchmal Vernetzung kann Proteine, die nur vorübergehend mit der DNA interagieren und haben keine funktionelle Bedeutung im Genregulation zu beheben. Darüber hinaus werden Antikörper gegen fixierten Peptide in der Regel ausgelöst. Daher wird Antikörperbesonderheit native ChIP erhöht. Allerdings ist es wichtig, im Auge zu behalten, die native ChIP nur anwendbar ist auf Histone oder anderen Proteinen, die eng an DNA binden zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt die native Chromatin Immunopräzipitation auf murine Gehirn Tumor Neurosphären.
Introduction
Epigenetische Ereignisse sind häufig in Gliome und wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Tumor. In der Tat in pädiatrischen hochwertige Gliom treten Mutationen in den Genen Codierung Histon-Varianten H3.3 und H3.1 häufig1. Die Mutationen beeinflussen Histon Änderungen und wichtige epigenetische folgen2,3. In der Jugendlichen zu Erwachsenen Spektrum auftreten, wiederkehrende Mutationen im Isocitrate Dehydrogenase Gen 1/2 (IDH1/2), eine Mutation, die α-KG abhängigen Histon und DNA-de-Methylasaes hemmt und genetische Veränderungen in den anderen Chromatin Aufsichtsbehörden wie ATRX und DAXX 4. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, wie Mutationen, die epigenetische Regulatoren beeinflussen ändern Chromatinstruktur und regulatorischen Histon Modifikationen, die sich erheblich von den Tumorzellen Transkriptom wiederum haben zu studieren.
Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bewertung der Auswirkungen der epigenetischen Veränderungen im Genom5,6,7. In native ChIP Chromatin ist mit micrococcal Nuklease (MNase), Immunoprecipitated mit einem Antikörper gegen das Protein des Interesses, verdaut und dann DNA wird aus dem Immunoprecipitated Chromatin komplexe6gereinigt. Zellen sind nicht während des Verfahrens festgelegt, so ist diese Technik nur für die Untersuchung von Proteinen, die eng mit DNA6interagieren. Das Fehlen der Vernetzung hilft Antikörperbesonderheit, da Antikörper in der Regel gegen fixierten Peptide oder Proteine7ausgelöst werden. Darüber hinaus, da gibt es keine Vernetzung Schritt, dies reduziert die Chancen der Festsetzung transiente Protein-DNA-Wechselwirkungen, die sind unspezifisch und nicht gesetzlichen7,8. ChIP kann verwendet werden, um die Anreicherung von Histon-Modifikationen in einer bestimmten genomic Region zu identifizieren. Hier zeigen wir ein Protokoll für Durchführung native ChIP in Neurosphären (NS) aus gentechnisch erzeugten Mausmodelle der Gliom entwickelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten ermöglicht den Benutzer durchführen native ChIP auf NS gentechnisch Hirntumoren abgeleitet. Im Gegensatz zur Vernetzung ChIP, beschränkt sich dieses Protokoll für das Studium der Proteine, die DNA6fest zugeordnet. Die Anzahl der verwendeten Zellen kann nach Bedarf geändert werden und das Protokoll kann hochskaliert werden. Wir haben 1 X 106 Zellen pro IP, native ChIP kann jedoch auch mit weniger als 4 x 104 Zellen5…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch nationale Institute der Gesundheit/National Institute of Neurological Disorders, R21-NS091555, M.G.C. & Schlaganfall (NIH/NINDS) Zuschüsse R37-NS094804, R01-NS074387 unterstützt; NIH/NINDS gewährt R01-NS076991 R01-NS082311 und R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; der Abteilung für Neurochirurgie; Leahs Happy Hearts und Tschad obwohl Stiftung, M.G.C. und P.R.L. RNA Biomedizin Grant F046166, M.G.C. F.M.M. wird unterstützt durch eine F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. wird unterstützt durch das NIH / NIGMS grant 5T34GM007821-37.
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Riferimenti
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