Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization
Summary
Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.
Abstract
Virüs gibi parçacıklar (VIP) nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya algılama ve çeşitli hastalıkların tedavisinde küçük moleküller teslim etmek için kullanılmaktadır. Bu uygulama üzerinde genetik değişiklik, kendinden montajlı dayanır ve sistein konjügasyon, rekombinant VIP’ler. tümör hedefleme uygulama yerine getirmek ile genetik karşılaştırıldığında yabancı peptidler VIP’ler için değişiklik yalnız, kimyasal konjugasyon sunar bir önemli avantaj varlıkları, sentetik peptidler veya oligosakkaritler VIP yüzeye bir modüle edilmiş ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan Birleşik, gibi çeşitli sağlar çünkü.
Burada, biz nasıl hepatit E virüs nanopartikül (HEVNP), bir modularized theranostic kapsülü, bir çok fonksiyonlu teslim taşıyıcı olarak kullanıldığını göstermektedir. HEVNPs fonksiyonlar doku hedefleme, görüntüleme ve tedavi teslim. HEVNP köklü yapısal araştırmaya dayalı, yapısal olarak bağımsız ve yüzey Günese maruz kalan artıkları sistein yerine konjugasyon siteleri maleimide bağlı kimyasal gruplar thiol seçici bağlantıları üzerinden için seçildi. Belirli bir sistein-modified HEVNP (573, asparagine Cys yerine aa (HEVNP – 573C)) için bir meme kanseri hücre özgü ligand, LXY30 Birleşik ve tümör hedefli işleme yakın kızılötesi (Nur) floresan boya ile (Cy5.5), etiketli Etkili tanı kapsül (LXY30-HEVNP-Cy5.5) olarak HEVNPs. Benzer mühendislik stratejileri tanınmış atomik yapıları ile diğer makromoleküllerin kompleksleri ile theranostic teslim potansiyel uygulamalar keşfetmek için istihdam edilebilir.
Introduction
Nano ölçekli vektörel çizimler nanotheranostics bilinen tedavi ve teşhis teslimat gelişimi çok hedeflenen teslimat1doğru Genelleştirilmiş tedaviler uzak Biyomedikal alanının kaymıştır. Hedeflenen nanotheranostic teslim stabil bir belirli hastalıklı doku ya da biyokimyasal yol2,3,4 theranostic moleküller doğrudan theranostic molekülleri ile nano ölçekli vektörel çizimler (nano tanecikleri) entegre . Çünkü en iyi şekilde ölçekli nano tanecikleri kapasite theranostic molekülleri ise stabilize ve seçmeli olarak hedef hücre yüzey molekülleri hastalıklı dokuları üzerinde sunulan Nanomedicine hedeflenen teslimat ön plana geldi. Birçok nanotheranostic platformlar hala pasif hücre alımı, ön-olgun bozulması, toksisite ve yetersiz Derneği theranostic molekülleri ile muzdarip. VIP birçok hedeflenen teslimat bu engelleri aşmak. Bunlar nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya küçük moleküller teslim için kullanılmıştır: birçok hastalıkları1mücadele için kullanılan bir rejimi. Bu uygulama ağırlıklı olarak mülkiyeti üzerinde dayanır kendinden montajlı yanı sıra verilen VIP için tasarlanmış uygulama yerine getirmek için genetik değişiklikler kolaylığı. Genetik mühendisliği için karşılaştırıldığında, VIP için yabancı peptidler kimyasal konjugasyon varlıklar, peptidler veya VIP yüzeyine içinde bir modüle Birleşik oligosakkaritler, gibi çok çeşitli izin verdiği için önemli bir avantaj görüntüler ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan.
HEVNPs, rekombinant HEV kapsid protein, 2nd açık türetilen çerçeve (ORF2) okuma, bulaşıcı olmayan, kendi kendine capsids giriş ve hücre-bağlama verebilir montaj. HEV Mukozal iletimi için evrim çünkü monte kapsid protein proteolitik ve asidik Mukozal koşulları5‘ te aynı şekilde stabil. HEVNPs içi boş, T şeklinde depolama ve hem de sert fizyolojik koşulları son derece kararlı işleme oluşan 60 aynı birim6,7 , ORF2, / 1 icosahedral kapsid, =. Herhangi bir virüs genetik öğe eksik, verimli, yüksek verim üretim baculovirus ifade sistem böcek hücrelerinde yoluyla elde edilir. Onların proteolitik istikrar nedeniyle, kendi kendine monte HEVNPs çıkarılan ve süpernatant cep gerekli arıtma adımları önemli ölçüde azaltarak saf. Ayrıca, HEVNPs kararlı bir icosahedral üs için esnek bir menteşe ile bağlı bir yüzey maruz çıkıntı etki (P) sahip. Esnek menteşe, önemli temel icosahedral yapısı ödün vermeden P etki alanı değiştirmek olanak verir iken yüzey maruz sivri icosahedral Bankası üstüne P etki alanı oluşturur. 60 tekrarlanan birimleri ile kimyasal modülasyon için 60 simetrik siteleri tek siteye özgü değişiklik sonuçlanır. Son zamanlarda, bir nano-platform önerilen kimyasal ligandlar veya theranostic uygulamalar için küçük moleküller eşlenik HEVNP kullanarak. Bu tek bir amino asit ile sistein HEV-VIP çıkıntı etki tepki site maleimide bağlı peptidler veya molekül ile değiştirerek sağlanır. HEV-VIP ve iyi okudu immünojenik epitopları8,9önceki yapısal çözümleme bağlı olarak, aşağıdaki beş HEV-VIP amino asitler olarak potansiyel adaylar sistein ile değiştirildi: Y485C, T489C, S533C, N573C ve T586C ( Şekil 1). İfade ve arıtma böcek hücrelerden sonra onların VIP oluşumları transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gözlem (Şekil 2) tarafından teyit edildi ve maruz sistein siteleri Western tarafından analiz edildi leke maleimide bağlı biotin sonra fiil (Şekil 2). Beş mutantlar arasında HEVNP – 573C maleimide-biotin konjugasyon (Şekil 2) en güçlü sinyal göstermek ve nanocarrier meme kanser hücresi4 (şekil 3) hedefleme için gücümüzü izleme için kullanıldı.
Bu iletişim kuralı tümör hedefleme molekülleri HEVNPs için yüzey sistein konjugasyon eklemek için kimyasal konjugasyon yöntemleri gösterilmektedir. Rekombinant HEVNPs içeren N573 adlı bir sistein ile tümör hedefleme ve algılama molekülleri’tümör dır konjugasyon detay (HEVNP – 573C). Peptid, forma LXY30-HEVNP (şekil 4) LXY3010 HEVNPs için hedefleme meme kanser tümörü bağlamak için bir tıklama kimya konjugasyon işlemdir üzerinde duruldu. Daha sonra N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 LXY30-HEVNP-Cy5.5 floresan algılama için her iki vitro (şekil 5) oluşturmak için HEVNPs ayrı Lys ücreti için Birleşik ve içinde vivo4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genellikle hafta sürer, zaman alıcı genetik mühendisliği yordamı aksine burada biz basit iki adım ve ligand hedefleme kanser ekleme 3 gün içinde tamamlanabilir tek adımlı kimyasal konjugasyon yordamlar göstermek ve/veya Floresans algılama boya HEVNPs Cys/Lys sitelerine. Teknik-ebilmek var olmak kullanılmış için en iyi ligand hedef ekran aday havuzu ve böylece mevcut peptit/küçük molekül sentezi Hizmetleri makul maliyet ve teslimat teker yararlanır.
Geleneksel genetik han…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar tarafından NIH RHC için fon sponsorluk kabul vermek #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, Ulusal Enstitüsü gıda ve tarım gibi Finlandiya ayırt edici Profesör programı.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
Riferimenti
- Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
- Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
- Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
- Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
- Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
- Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
- Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
- Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
- Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
- Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
- Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
- Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
- Technologies, N. b. L. . Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).
- Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).
