Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vise hvordan celle photoconversion er oppnådd gjennom UV eksponering til bestemte områder uttrykke fluorescerende protein, Eos, i levende dyr.
Abstract
Dyre- og plantelivet vev består av forskjellige populasjoner av celler. Disse cellene samhandle over tid å bygge og vedlikeholde vevet og kan forårsake sykdom når forstyrret. Forskere har utviklet smart teknikker for å undersøke egenskapene og naturlig dynamikken i disse cellene i intakt vev ved å uttrykke fluorescerende proteiner i undergrupper av celler. Men til tider krever eksperimenter mer valgte visualisering av celler i vevet, noen ganger på én celle eller populasjon av celler måten. For å oppnå dette og visualisere enkeltceller i en populasjon av celler, har forskere benyttet encellede photoconversion fluorescerende proteiner. For å demonstrere denne teknikken, viser vi her hvor å direkte UV lys til en Eos-uttrykke celle interesse en intakt, lever sebrafisk. Vi deretter bildet photoconverted Eos+ cellene 24 timer senere for å finne ut hvordan de endret i vevet. Vi beskrive to teknikker: cellen photoconversion og photoconversions av befolkningen i cellen. Disse teknikkene kan brukes å visualisere celle-celle interaksjoner, celle-skjebne og differensiering og celle migrasjoner, gjør det en teknikk som brukes i mange biologiske spørsmål.
Introduction
Flere forskjellige celler samhandle for å bygge og vedlikeholde komplekse dyre- og plantelivet vev. Disse cellene er ofte under sommer og vanskelig å skille fra naboer på en enkelt cellenivå uten høy oppløsning mikroskopi som krever fiksering av vev. Men å forstå hvordan disse vev form, er vedlikeholdt, og blir syk, har det vært viktig å undersøke hvordan single celler i vevet bruker over tid. Ideelt krever disse eksperimentene merkingen av single celler innenfor en vev på en ikke-invasiv måte uten krav til fiksering. Forskere har nå utviklet mange teknikker for å oppnå dette oppgave1,2,3,4.
Oppdagelse og gjennomføring av maneter grønne fluorescerende protein (GFP) var en spennende tilnærming som tillatt for merking av forskjellige celler i en vev miljø1. Bruker celle-spesifikke arrangører, er det genetisk velge et delsett av celler som er merket1. Viral indusert uttrykk for GFP kan også benyttes for bruker-valgte uttrykk for GFP3,4. Selv om det er ganske nyttig, tillater genetisk mediert uttrykk for GFP ikke brukervalgt uttrykket i et delsett av celler i vevet; og viral uttrykk for GFP, men en fordel, kan invasiv. Med ankomsten av GFP derivater og smarte teknikker som Brainbow å uttrykke distinkte fluorescerende proteiner mer tynt i vev, har det blitt mulig å visualisere enkeltceller og samspill mellom dem i komplekse vev2, 5. men disse tilnærmingene merke celler i en tilfeldig måte. Hvis ønsket eksperimentet krever visualisering av en enkelt celle eller populasjon av celler som er definert av eksperimentator, er de derfor begrenset. Med slike eksperimenter, ville det være en fordel å ha en genetisk uttrykt fluorescerende protein som kan manipuleres til å skille, i en enkelt celle mote, det fra andre fluorescerende og ikke-fluorescerende celler.
For å oppnå dette målet og visualisere cellebiologi på enkeltceller i en kompleks levende vev, bruker det vitenskapelige samfunnet enkelt celle photoconversion av forskjellige fluorescerende proteiner6,7,8. Bruke genetisk kontrollert uttrykk for et photoconvertible protein (dvs., eos, kaede, etc.) som går fra en grønn til rød fluorescerende tilstand når de utsettes for UV (488 nm) lys, vi kan skille en enkelt celle fra dens fluorescently merket naboer6,7,8. Denne tilnærmingen benytter et apparat koblet til vår AC confocal mikroskop som kan direkte lys fra en laser stabel til et Diffraksjon-begrenset område av interesse. Med denne teknikken, kan vi enten merke enkeltceller eller større bestander i en brukerdefinert måte9,10,11. Teknikken er minimal invasiv sammenlignet enkeltcelle injeksjoner av viral GFP. Som et bevis på konseptet viser vi at vi kan photoconvert enkeltceller i en ganglion i perifere nervesystemet og photoconvert større bestander som celler plassert på ventral side av ryggmargen9,10, 11,12. Vi kan deretter visualisere disse photoconverted celle populasjoner 24 timer senere for å få innsikt i deres bevegelser og differensiering under utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I komplekse vev organisere forskjellige celletyper i bestemte domener. Nylig har teknikker vært benyttet i etiketten enkeltceller i disse store vev strukturer1,2,3. Her viser vi to teknikker som kan på samme måte brukes til å visualisere både enkeltcelle interaksjoner og celle befolkningen interaksjoner i komplekse vev. Fordelen med photoconversion teknikken er romlige kontrollen forskeren har tydelig merket en celle. Med e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bernard Kulemaka og medlemmer av det Smith for deres nyttige kommentarer og reagens veiledning, Sam Connell og Brent Redford av 3i for fielding tenkelig spørsmål og Deborah Bang, Karen Heed og Kay Stewart for sebrafisk omsorg. Dette arbeidet ble støttet av University of Notre Dame, Elizabeth og Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Center for sebrafisk forskning ved University of Notre og sentrum av stamceller og regenerativ medisin ved University of Notre Dame. Alle dyrestudier ble gjort i samsvar med University of Notre Dame IACUC til Dr. Cody Smith.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
Riferimenti
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
