Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie
Summary
Nous présentons un protocole pour microscopie STED simultanément les structures image actine, microtubules et protéines microtubule bout plus contraignantes dans les cellules de B qui se sont propagés sur lamelles recouvertes d’anticorps dirigés contre le récepteur des cellules B, un modèle pour la phase initiale de formation de la synapse immunitaire.
Abstract
Les lymphocytes B qui se lient aux antigènes membranaires (par exemple, sur la surface d’une cellule de présentatrices) forment une synapse immunitaire, une structure cellulaire spécialisée qui optimise la signalisation de cellules B récepteur (BCR) et acquisition d’antigène induite par la BCR. Le remodelage du cytosquelette d’actine et de la réorientation de la réseau de microtubules vers le site de contact de l’antigène sont essentiels pour la formation des synapses immunitaire. Remodelage du cytosquelette d’actine dans un anneau périphérique dense d’actine-F est accompagnée par la polarisation du pôle Organisation des microtubules vers la synapse immunitaire. Protéines microtubule bout plus contraignantes, ainsi que les protéines corticale plus-fin capture la médiation des interactions physiques entre l’actine et des microtubules cytosquelettes, qui leur permettent d’être réorganisé de manière coordonnée. Élucider les mécanismes que cette réorganisation du cytosquelette, mais aussi comprendre comment ces structures du cytosquelette façonner la formation des synapses immunitaire et BCR de signalisation, de contrôle peuvent apporter un nouvel éclairage sur l’activation des lymphocytes B. Cela a été favorisé par l’élaboration de méthodes de microscopie de Super-résolution qui révèlent de nouveaux détails de l’organisation en réseau du cytosquelette. Nous décrivons ici une méthode pour microscope émission stimulée épuisement (STED) simultanément les structures image actine, microtubules et plus-fin transfectées GFP-étiquetée microtubule protéines dans les cellules de B. Pour modéliser les événements précoces dans la formation des synapses immunitaire, nous laisser diffuser sur lamelles enduites d’anticorps de anti-l’immunoglobuline (anti-Ig), qui déclenchent la BCR de signalisation et de remodelage du cytosquelette des cellules B. Nous fournissons des protocoles étape par étape pour exprimer les protéines de fusion de GFP dans des cellules A20 B-lymphome, pour la diffusion cellulaire induite par l’anti-Ig et pour la fixation ultérieure de cellule, immunomarquage, acquisition d’images et image déconvolution étapes. Les images haute résolution obtenues à l’aide de ces procédures permettent de visualiser simultanément les structures de l’actine, les microtubules et les protéines de liaison de plus en bout de microtubules qui peuvent lier ces deux réseaux du cytosquelette.
Introduction
Quand les cellules B lient à polarisé tableaux d’antigènes (p. ex., affichés sur l’aire des présentatrices d’antigène cellules (CPA)), le récepteur des cellules B (BCR) qui en résulte la formation d’une structure classique de synapse immunitaire, qui a été décrit dans les disques de signalisation T les cellules1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Au départ, amas de forme de RCO antigène liée à la périphérie de la cellule B : APC Contactez le site. Ces amas se déplacent ensuite vers le centre du site contact de l’antigène, où ils se fondre en une grappe d’activation supramoléculaire central (cSMAC) qui constitue le noyau de la synapse immunitaire. La formation des synapses immunitaire optimise la signalisation de la BCR et facilite l’extraction induite par la BCR l’antigène de la membrane APC14. Cette acquisition d’antigène, qui est suivie de l’internalisation médiée par BCR antigène et du traitement subséquent de l’antigène, permet aux cellules de B de présenter peptide : MHC complexes II aux cellules T et susciter des lymphocytes T aide14. Parce que la formation des synapses immunitaire favorise l’activation des lymphocytes B, élucider les mécanismes qui établissent que ce schéma fonctionnel de l’organisme récepteur peut fournir de nouveaux aperçus de comment d’immunité humorale sont initiées ou réglementés.
Réorganisation de l’actine et microtubules cytosquelettes est essentielle pour la formation des synapses immunitaire. BCR localisé signalisation stimulée par un tableau polarisé dans l’espace des antigènes induit rapide et spectaculaire de remodelage de l’actine cytosquelette1,15. La formation de structures dendritiques actine à la périphérie de la cellule B exerce des forces poussant sur la membrane plasmique et favorise la propagation des cellules B. Cela permet à la cellule B balayer une surface plus grande de la surface de l’antigène-roulement et augmente le nombre des RCO qui se lient à l’antigène et activer la BCR, voies de signalisation. Dans le même temps, la MTOC et le réseau de microtubules sont réorientés vers le site de contact de l’antigène. La MTOC approche le site contact de l’antigène, les microtubules émanant de la MTOC s’étendent le long de la face interne de la membrane plasmique à l’interface entre la cellule de B et de l’antigène-roulement surface16,17. Ces microtubules juxtamembrane peuvent alors servir de pistes pour le mouvement centripète dynéine-mediated de liaison antigène BCR amas18, conduisant à la formation d’un cSMAC.
La réorientation et la polarisation de la MTOC vers la synapse immunitaire nécessite l’actine intact et cytosquelettes des microtubules et dépend souvent des interactions entre l’actine corticale réseau et les microtubules16,17, 19,20. Protéines actine corticales, tels que IQGAP1, peuvent capturer des microtubules en interagissant avec des complexes protéiques qui décorent les microtubules plus-extrémités21. Ces dynamiques complexes de protéines liant le bout plus incluent EB1 et CLIP-170, qui sont collectivement désignés comme les microtubules plus-fin suivi de protéines (+ conseils)21,22. + Conseils aux extrémités des microtubules peuvent se lier aux protéines qui sont associées à la membrane plasmique ou le cytosquelette d’actine corticale. Cela permet les mécanismes générateurs de force (par exemple, la fin du moins de mouvement de dynéine corticalement ancrés le long des microtubules dirigé) pour exercer une force de traction sur les microtubules et ainsi replacer la MTOC. CLIP-170 peut se lier à la protéine d’échafaudage associées à l’actine IQGAP123, et nous avons montré que tous les deux de ces protéines sont nécessaires pour la polarisation induite par le BCR MTOC vers la synapse immunitaire17. Cette interaction IQGAP1-CLIP-170 peut jouer un rôle clé dans le remodelage du cytosquelette d’actine avec le repositionnement de la réseau de microtubules à la synapse immunitaire de B-cellule de coordination.
La microscopie en fluorescence conventionnelle a révélé la réorganisation dramatique de l’actine et des microtubules cytosquelettes lors de B-cellule immunitaire synapse formation2. Toutefois, cette approche ne peut pas résoudre les petites structures cellulaires en détail en raison de la limite de diffraction de la lumière, qui, conformément à la Loi de l’Abbe, dépend de la longueur d’onde de la lumière utilisée pour éclairer l’échantillon et l’ouverture de l’ objectif24. Cette limite de diffraction limite la résolution des microscopes à lumière conventionnelles à 200-300 nm dans le sens latéral et de 500 à 700 nm dans le sens axial25. Par conséquent, plus petites structures subcellulaires, ainsi que les détails fins de l’actine et des microtubules cytosquelettes, pourraient être observées seulement au microscope électronique. Microscopie imagerie du cytosquelette prend du temps, nécessite des protocoles de fixation et préparation de témoin sévères qui peuvent altérer les structures biologiques et sont limite à médiée par les anticorps de détection. La capacité de réagissent et simultanément plusieurs protéines d’image ou de structures cellulaires est un avantage considérable de la microscopie de fluorescence. Par ailleurs, exprimant des protéines de fusion fluorescent dans des cellules permet une imagerie en temps réel et est utile lorsque des anticorps efficaces pour immunostaining la protéine d’intérêt ne sont pas disponibles.
Les progrès technologiques récents en microscopie de Super-résolution ont dépasser les limites de la diffraction de la lumière et a permis la visualisation des nano structures cellulaires24. Une telle technique de microscopie de Super-résolution est appelée émission stimulée épuisement (STED) microscopie. STED emploie deux lasers, où un seul laser excite le fluorophore et un deuxième laser avec un motif en forme de beignet sélectivement supprime l’émission de fluorescence autour le fluorophore. Ceci réduit la fonction de point-propagation (zone apparente) d’une seule particule fluorescente et fournit une diffraction sous limite image fluorescente25,26. Microscopie de l’appauvrissement de l’état fondamental emploie également basés sur la fluorescence des techniques d’acquisition d’images de Super-résolution. Cependant, les temps d’acquisition et de la reconstruction image sont longs, il y a seulement un nombre limité de fluorophores qui peut être utilisés, et l’imagerie haute résolution simultanée de plusieurs composants du cytosquelette est techniquement difficile parce qu’il est maintenant structures d’actine et les microtubules nécessite des procédures différentes de fixation. Par conséquent, STED a plusieurs avantages par rapport à la microscopie électronique et autre microscopie Super-résolution s’approche car elle offre d’acquisition d’images rapide, a des exigences minimales de post-traitement et emploie les mêmes fluorophores et techniques de coloration qui sont utilisés pour la microscopie de fluorescence conventionnels d’échantillons fixe26.
Super-résolution microscopie a maintenant été utilisée pour visualiser des structures de l’actine à la synapse immunitaire aux cellules tueuses naturelles de (NK) et T cellules26,27,28,29,30, 31. Toutefois, imagerie de Super-résolution du cytosquelette de microtubules, ainsi que la réorganisation coordonnée de l’actine et des microtubules cytosquelettes au cours de la formation des synapses immune, a seulement récemment rapporté17. Nous avons utilisé la microscopie STED pour les cellules d’image B qui avaient été autorisées à diffuser sur les lamelles enduites d’anticorps de anti-l’immunoglobuline (anti-Ig), qui stimulent la BCR de signalisation et de lancer la réorganisation du cytosquelette. Quand plaqué sur les anticorps anti-Ig immobilisés, les cellules B subissent dramatique s’étalant actine-dépendante, qui récapitule les événements initiaux au cours de la formation des synapses immunitaire. Ce qui est important, la microscopie STED a révélé les détails de l’anneau dendritique d’actine-F qui se forme à la périphérie du système immunitaire font synapse et a montré que la MTOC, ainsi que les microtubules attachées à elle, avaient déménagé à proximité de l’antigène contact site17. Ces microtubules étendu vers l’extérieur vers l’anneau périphérique d’actine-F. En outre, imagerie STED multicolore de diverses combinaisons de F-actine, tubuline, IQGAP1 et GFP-étiquetée CLIP-170 + conseils ont montré que les microtubules plus-extrémités marquées par CLIP-170-GFP étaient étroitement liés avec le réseau d’actine périphérique et IQGAP1, un corticale capture protéines17.
Nous présentons ici un protocole détaillé d’imagerie de l’actine et des microtubules cytosquelettes à la synapse immunitaire à l’aide de la microscopie STED. Ces méthodes ont été optimisées en utilisant la ligne de murin B cellule A20, qui a été largement utilisée pour l’étude de signalisation de la BCR et synapse immunitaire formation17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. parce que les anticorps commerciaux à CLIP-170 ne fonctionnent pas bien pour l’immunomarquage dans des expériences antérieures, nous décrivons en détail l’expression de la GFP-étiquetée CLIP-170 dans les cellules A20, ainsi que de protocoles pour visualiser simultanément jusqu’à la coloration trois éléments du cytosquelette ou protéines associées au cytosquelette. Méthodes pour l’utilisation de la microscopie STED à l’actine image aux synapses immunitaires de cellules NK ont été décrits précédemment40. Ici, nous étendre cela à acquérir des images de Super-résolution multicolore de cytosquelettes fois l’actine et les microtubules dans les cellules de B.
Un facteur critique pour la microscopie de Super-résolution est en utilisant les procédures de fixation appropriés pour le maintien des structures cellulaires et prévenant les dommages aux protéines fluorescentes. La fixation et coloration des méthodes présentées ici ont été optimisés afin de conserver la fluorescence GFP et fournir une imagerie des réseaux actine et les microtubules. En exprimant des protéines fluorescentes, il convient de noter que les cellules B sont généralement difficiles à transfecter. Utilisant ce protocole, 20-50 % de l’A20, cellules expriment généralement la protéine de fusion de GFP transfectée, et parmi cette population, les niveaux d’expression de protéine sont variables. Néanmoins, l’imagerie Super-résolution d’actine et les microtubules en utilisant les procédures que nous décrivons est assez robuste et sont facilement obtenir des images de haute qualité. Malgré leur petite taille par rapport aux cellules A20, nous montrons que ces procédures peuvent également servir à l’image du réseau de microtubules dans les cellules de B primaires qui ont été brièvement activés avec le lipopolysaccharide (LPS). Nous avons montré qu’activés par le LPS des cellules de B primaires peuvent être transfectées avec siARN à relativement haute efficacité (c.-à-d., tels que l’appauvrissement de protéine peut être détectée par immunoblotting), ce qui les rend une bonne alternative à l’utilisation de lignées cellulaires B pour certaines études 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des images détaillées des structures du cytosquelette peuvent être obtenus à l’aide de la microscopie STED Super-résolution, qui peut théoriquement atteindre une résolution de 50 nm, par rapport à la microscopie confocale classique, pour lequel la résolution diffraction-limited est ~ 200 nm 24. la capacité de résoudre des structures plus fines est encore améliorée en utilisant un logiciel de déconvolution pour calculer la position très probablement de la source lumineuse originale…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging Facility pour soutenir et maintenir le microscope STED. Ce travail a été financé par subvention #68865 de l’instituts de recherche en santé du Canada (de M.R.G.). Nous remercions m. Kozo Kaibuchi (Université de Nagoya, Nagoya, Japon) pour le plasmide CLIP-170-GFP.
Materials
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
Riferimenti
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