В естественных условиях Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры
Summary
Здесь мы представляем пробирного сосудистой проницаемости мозга мыши, используя внутрибрюшинного введения флуоресцентных Трейсеры следуют перфузии, которая применима к Животные модели blood – brain барьер дисфункции. Один hemi мозг используется для количественной оценки проницаемость и другой для трассировочного визуализации/иммуноокрашивания. Процедура занимает 5-6 ч для 10 мышей.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является специализированным барьер, который защищает мозг микроокружения от токсинов и патогенных организмов в циркуляции и поддерживает гомеостаза головного мозга. Основные сайты барьера являются эндотелиальных клеток капилляров мозга, функции которого барьер результаты от плотные межклеточные соединения и измеряем транспортеров, выраженные на плазматической мембраны. Эта функция регулируется pericytes и астроциты, которые вместе образуют блок нервно-сосудистых (NVU). Несколько неврологических заболеваний, таких как инсульт, болезнь Альцгеймера (AD), опухоли мозга, связанные с нарушениями функции BBB. Поэтому оценка проницаемости BBB решающую роль в оценке тяжести неврологических заболеваний и успех стратегий лечения.
Мы представляем здесь простой, но надежные проницаемость assay, который успешно применялся для нескольких мыши модели оба, генетические и экспериментальных. Метод является высоко количественных и объективной по сравнению с трассирующими флуоресцентный анализ по микроскопии, который часто применяется. В этом методе мышей внутрибрюшинно вводили с сочетанием водный инертных флуоресцентные Трейсеры следуют обезболивающим мышей. Сердца перфузии животных производится до сбора урожая, мозга, почек и других органов. Органы гомогенизации и центрифугируют следуют измерения флуоресценции от супернатант. Кровь из сердца пункция перед перфузии служит для цели нормализации сосудистой отсек. Ткани флуоресценции нормируется для мокрой веса и сыворотки флуоресценции для получения количественных трассирующими индекса проницаемости. Для дополнительного подтверждения контралатеральной hemi мозга сохраняется для иммуногистохимии могут быть использованы для трассировочного флуоресценции визуализация целей.
Introduction
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) состоит из микрососудистой эндотелиальных клеток (ECs), поддерживаемых тесно связаны pericytes (шт.), которые являются муфтами в базальной пластинки, и астроциты (АКГ), которые окутывают базальной мембраны с их конец ноги1 ,2. ECs взаимодействовать с несколькими типами клеток, которые поддерживают и регулируют функцию барьера, главным образом ACs и ПК, а также нейронов и микроглии, которые вместе формируют нервно-сосудистого блок (NVU). NVU имеет решающее значение для функции BBB, который ограничивает транспорта кровь токсинов и патогенных въезд в мозг. Эта функция является результатом жесткие соединения молекул, таких как Клаудин-5, occludin, zonula occludens-1, которые присутствуют, между ECs, а также из-за действий перевозчиков например р гликопротеина (P-gp), измеряем молекулы, которые вводят эндотелия обратно в судно просвета1,2,3. BBB однако позволяет для перевозки необходимых молекул, таких как питательные вещества (глюкозу, железа, аминокислоты) конкретных перевозчиками, выразили ЕС мембраны плазмы1,2,3. EC слой сильно поляризованных распространение различных перевозчиков между Люминал (кровь облицовки) и abluminal (оболочек мозга облицовки) для конкретных и векторных транспорта функция4,5 . В то время как BBB защитные отношении плотно регулирующих окружение ЦНС, это серьезной проблемой для доставки лекарств ЦНС при заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона с функциональной BBB. Даже в неврологических заболеваний с BBB дисфункции нельзя предположить, что мозг доставки лекарств увеличивается особенно дисфункции барьер может включать урон целям конкретных транспортер, например, как болезнь Альцгеймера (AD). В AD несколько бета амилоида перевозчиков, таких как LRP1, ярость, P-gp известны как dysregulated и следовательно ориентация этих перевозчиков может быть бесполезным6,,78. BBB нарушениями в нескольких неврологических заболеваний, таких как инсульт, AD, менингит, склероза и в мозгу опухоли9,10,11. Таким образом важно его оценки и восстановление барьерной функции является важной частью терапевтические стратегии.
В этой работе мы описали объективную и количественный протокол для assay проницаемость грызунов, что мы успешно применяется несколько линий мыши оба заболевания трансгенных и экспериментальной модели10,12,13 ,14. Метод основан на простой внутрибрюшинного введения флуоресцентных Трейсеры следуют перфузии мышей для удаления Трейсеры из сосудистого отсека. Мозга и других органов являются собранные пост перфузии и проницаемость, оценивать объективную и абсолютной проницаемости индекс, основанный на измерениях флуоресценции гомогенатах ткани на тарелку читателя. Все сырье флуоресценции значения корректируются для фона с помощью ткани гомогенатах или сыворотки от Шам животных, которые не получают любой трассировщик. Достаточно нормировок включены в объем сыворотки, сыворотка флуоресценции и вес ткани, таким образом давая индекса проницаемости, которая является абсолютным и сопоставимых между экспериментов и типы тканей. Для облегчения сравнения между группами абсолютной проницаемости значения индекса могут быть легко преобразованы соотношений как мы выполняли ранее12. Одновременно хранимые hemi мозги и почек могут быть использованы для визуализации трассирующими микроскопии флуоресцирования10. Классический флуоресцентной микроскопии может быть ценным в получении региональные различия в проницаемости, хотя и громоздким из-за субъективный выбор разделов ткани и изображений для полуколичественного анализа. Подробные шаги представлены в протоколе и примечания добавлены при необходимости. Это обеспечивает необходимую информацию для успешного выполнения пробирного проницаемости в естественных условиях в мышей, которые можно масштабировать до других мелких животных. Assay может применяться для многих видов трассировщиков заряд и размер на основе оценки проницаемость сочетанием Трейсеры с спектры флуоресценции отдельных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дисфункции Blood – brain барьер связан с рядом неврологических расстройств, в том числе начального и среднего мозга опухоли или инсульта. BBB разбивка часто ассоциируется с угрожающей жизни ЦНС отек. Выяснение молекулярных механизмов, которые вызывают открытие или закрытие BBB поэтому терапев…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать Sphingonet консорциум, финансируемой Фондом Leduq для поддержки этой работы. Эта работа была также поддержана сотрудничество исследовательский центр «сосудистые дифференциации и реконструкции» (CRC / Transregio23, проект C1) и 7. FP, COFUND, Гете международного постдока программы GO-IN, № 291776 финансирования. Мы также признаете Кэтлин Sommer ее технической помощи с мышами, обработки и генотипирования.
Materials
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
Riferimenti
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
- Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
- Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer’s disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
- Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
- Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
- Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
- Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
- Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
- Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
- Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
- Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
- Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
- Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -. Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
- Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).
