Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed – hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.
Bloed – hersenbarrière (BBB) is een gespecialiseerde barrière die de hersenen communicatie beschermt tegen toxinen en ziekteverwekkers in het verkeer en onderhoudt de homeostase van de hersenen. De belangrijkste sites van de barrière zijn endotheliale cellen van de haarvaten van de hersenen waarvan barrièrefunctie het gevolg is van strakke intercellulaire kruispunten en efflux vervoerders uitgedrukt op het plasma-membraan. Deze functie wordt geregeld door de pericytes en de astrocyten die samen de neurovasculaire eenheid (NVU vormen). Verschillende neurologische aandoeningen zoals beroerte, de ziekte van Alzheimer (AD), hersentumoren worden geassocieerd met een verminderde functie van de BBB. Beoordeling van de BBB-permeabiliteit is daarom cruciaal bij de beoordeling van de ernst van de neurologische ziekte en het succes van de behandelingsstrategieën werkzaam.
Wij presenteren hier een eenvoudige, maar robuuste permeabiliteit assay die met succes zijn toegepast op verschillende muis zowel, genetische en experimentele modellen. De methode is zeer kwantitatieve en objectieve in vergelijking met de analyse van de fluorescentie tracer door microscopie dat algemeen wordt toegepast. Bij deze methode worden muizen intraperitoneally ingespoten met een mengeling van waterige inerte fluorescerende traceurs gevolgd door anesthetizing van de muizen. Cardiale perfusie van de dieren wordt uitgevoerd vóór de oogst van de hersenen, nieren of andere organen. Organen worden gehomogeniseerd en gecentrifugeerd gevolgd door fluorescentie-meting van de bovendrijvende substantie. Bloed getrokken uit de cardiale punctie net voordat perfusie voor normalisatie doel tot de vasculaire compartiment serveert. De fluorescentie van weefsel is genormaliseerd naar de natte gewicht en serum fluorescentie te verkrijgen een kwantitatieve tracer permeabiliteit index. Voor extra bevestiging, kan de contralaterale hemi-hersenen bewaard voor immunohistochemistry voor tracer fluorescentie visualisatie doeleinden worden gebruikt.
De bloed – hersenbarrière (BBB) bestaat uit de microvasculaire endotheliale cellen (ECs) ondersteund door nauw pericytes (PCs), die ensheathed in de basale lamina, en astrocyten (ACs), die het membraan van de kelder met hun einde-voeten1 omhullen ,2. ECs interactie met verschillende celtypes die ondersteuning en regelen de barrièrefunctie, vooral ACs en PC’s, en ook neuronen en microglia, die allemaal samen de neurovasculaire eenheid (NVU vormen). De NVU is van cruciaal belang voor het functioneren van de BBB, waardoor het vervoer van bloed van toxinen en ziekteverwekkers uit het invoeren van de hersenen wordt beperkt. Deze functie is een gevolg van strakke-junctie moleculen zoals claudin-5, occludin, zonula occludens-1, die aanwezig zijn tussen de ECs en ook als gevolg van het optreden van vervoerders zoals p-Glycoproteïne (P-gp) dat efflux moleculen die worden ingevoerd door het endotheel terug in het vaartuig lumen1,2,3. De BBB zorgt echter voor het vervoer van essentiële moleculen zoals voedingsstoffen (ijzer, glucose, aminozuren) door specifieke vervoerders uitgedrukt op de EG plasma membranen1,2,3. De EG-laag is zeer gepolariseerd met betrekking tot de verdeling van de verschillende vervoerders tussen de luminal (bloed-gerichte) en abluminal (hersenen gerichte membranen) te voorzien in de specifieke en vectoriële vervoer functie4,5 . Terwijl de BBB beschermend met betrekking tot strak regulering van de CNS-omgeving is, is het een grote uitdaging voor CNS drug levering in ziekten zoals Parkinson met een functionele BBB. Zelfs in neurologische ziekten met BBB dysfunctie, kan niet er worden aangenomen dat de hersenen drug levering wordt verhoogd naarmate de barrière disfunctie kan ook schade aan de doelen van de specifieke vervoerder bijvoorbeeld zoals de ziekte van Alzheimer (AD). In AD, verschillende bèta amyloid vervoerders zoals LRP1, woede, P-gp bekend is dat ze dysregulated en daarom richten deze vervoerders zou zinloos6,7,8. De BBB is geschaad in verschillende neurologische aandoeningen zoals beroerte, AD, meningitis, MS, en in de hersenen tumoren9,10,11. Herstel van de barrièrefunctie is een cruciaal onderdeel van de therapeutische strategie, en dus haar beoordeling is van cruciaal belang.
In dit werk, hebben wij beschreven een objectieve en kwantitatieve protocol voor permeabiliteit assay in knaagdieren dat we met succes op verschillende muis lijnen beide transgene en experimentele ziekte modellen10,12,13 toegepast ,14. De methode is gebaseerd op een eenvoudige intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie van de muizen te verwijderen van de traceurs van de vasculaire compartiment. Hersenen en andere organen zijn verzamelde post perfusie en permeabiliteit beoordeeld door een doelstelling en absolute permeabiliteit index op basis van metingen van de fluorescentie van weefsel homogenates in een afleesapparaat. Alle ruwe fluorescentie waarden worden gecorrigeerd voor de achtergrond met behulp van weefsel homogenates of serum van sham dieren die niet elke tracer ontvangt. Ruime belangrijk zijn opgenomen voor serum volume, serum fluorescentie, en het gewicht van de weefsels, dus opbrengst permeabiliteit-index die is absoluut en vergelijkbare tussen experimenten en weefseltypes (HLA). Voor het gemak van vergelijking tussen groepen, kunnen de absolute permeabiliteit indexwaarden worden gemakkelijk omgezet naar ratio’s zoals we eerder12had uitgevoerd. Gelijktijdig, kunnen opgeslagen hemi-hersenen en nieren worden gebruikt voor tracer visualisatie door fluorescentie microscopie10. De klassieke fluorescentie microscopie heel waardevol in het verkrijgen van regionale verschil in permeabiliteit zij omslachtig als gevolg van subjectieve selectie van weefselsecties en afbeeldingen voor een semi-kwantitatieve analyse kan zijn. De gedetailleerde stappen worden gepresenteerd in het protocol en notities worden toegevoegd waar nodig. Dit biedt de nodige informatie voor het succesvol uitvoeren van de permeabiliteit in vivo bepaling in muizen die kunnen worden geschaald naar andere kleine dieren. De bepaling kan worden toegepast op vele soorten traceurs waardoor de lading en de grootte op basis van permeabiliteit beoordeling door een combinatie van verklikstoffen met verschillende fluorescentie spectra.
Bloed – hersenbarrière dysfunctie wordt geassocieerd met een aantal neurologische aandoeningen, met inbegrip van de primaire en secundaire hersentumor of beroerte. BBB-verdeling wordt vaak geassocieerd met levensbedreigende CNS oedeem. Het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die leiden de opening tot of sluiting van de BBB wordt daarom van therapeutische belang in neurologische aandoeningen en vaak onderzocht door onderzoekers. Methoden te onderzoeken BBB permeabiliteit in vivo gemeld in de literatuur, zi…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil erkennen Sphingonet consortium gefinancierd door de Leduq foundation ter ondersteuning van dit werk. Dit werk werd ook ondersteund door het Collaborative Research Center “vasculaire differentiatie en remodeling” (CRC / Transregio23, Project C1) en door de 7. FP, COFUND, Goethe internationale Postdoc programma GO-IN, No. 291776 financiering. Wij erkennen verder Kathleen Sommer voor haar technische bijstand met muizen, behandeling en genotypering.
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
384-well black plate | Greiner | 781086 | |
slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
microcentrifuge | eppendorf | 5415R |