En enkel hög verkningsgrad protokoll för bukspottskörteln ö isolering från möss

Summary

Detta ö-isolerings protokoll beskrev en ny väg av kollagenasinjektion för att smälta den exokrina vävnaden och en förenklad gradient förfarande för att rena kobbar från möss. Det handlar om enzymatisk matsmältning, gradient separation/rening, och Islet handplockning. Lyckad isolering kan ge 250 – 350 hög kvalitet och fullt fungerande öar per mus.

Abstract

Pankreasöarna, även kallade Langerhanska öar, är ett kluster av endokrina celler som producerar hormoner för glukos reglering och andra viktiga biologiska funktioner. Kobbar består främst av fem typer av hormonutsöndra celler: α-celler utsöndrar glukagon, β-celler utsöndrar insulin, δ-celler utsöndrar somatostatin, ε-celler utsöndrar ghrelin och PP-celler utsöndrar pankreaspolypeptid. 60 till 80% av cellerna i kobbar är β-celler, som är den viktigaste cellpopulationen för att studera insulinsekretion. Pankreasöar är ett viktigt modellsystem för att studera ex vivo insulinsekretion. Att förvärva högkvalitativa öar är av stor betydelse för diabetesforskningen. De flesta ö isolering förfaranden kräver tekniskt svårt att få tillgång till platsen för kollagenase injektion, hårda och komplexa rötning förfaranden, och flera densitet lutning rening steg. Detta papper har en enkel hög avkastning mus ö isolering metod med detaljerade beskrivningar och realistiska demonstrationer, som visar följande specifika steg: 1) injektion av kollagenas P vid ampulla av Vater, ett litet område som förbinder bukspottskörteln kanalen och den gemensamma gallgången, 2) enzymatisk matsmältning och mekanisk separation av exokrina bukspottkörteln, och 3) en enda gradient reningssteg. Fördelarna med denna metod är injektion av matsmältnings enzym med hjälp av mer tillgängliga ampulla av Vater, mer fullständig matsmältning med kombinationen av enzymatiska och mekaniska metoder, och en enklare enkelgradient rening steg. Detta protokoll producerar cirka 250 — 350 öar per mus; och holvar lämpar sig för olika ex vivo-studier. Möjliga förbehåll för detta förfarande är potentiellt skadade öar på grund av enzymatisk matsmältning och/eller långvarig gradient inkubation, som alla kan i stort sett undvikas genom noggrann annons motivering av inkubationstiden.

Introduction

Det finns två vanliga metoder i litteraturen för bukspottskörteln ö isolering. Man kräver excising bukspottkörteln och tärning det i små bitar med hjälp av kirurgisk sax, och sedan smälta det i en kollagenase lösning^1,2,3. En annan mer exakt metod är att använda nätverket av kanaler som finns i bukspottkörteln att införa matsmältningsorganen enzym. Följande platser har använts för mag enzym injektion: korsningen av galla och cystisk kanal, gallblåsan i gallgången, eller den gemensamma gallgången själv^1,4,5. Det är känt att holnor inte är jämnt fördelade i bukspottkörteln; mjälten regionen innehåller de mest öar⁶. Medan den andra metoden med anatomiska vägar för att leverera matsmältningsenzymer möjliggör en mer komplett perfusion av bukspottkörteln, inklusive mjälten regionen, detta förfarande kräver ofta fastspänning eller suturering av ampulla av Vater som är tekniskt Utmanande. När det gäller ö rening, flera densitet gradienter, samt cell silar och magnetisk retraktion har använts för att rena öarna^3,7. Utnyttjandet av dessa gradienter kan vara tidskrävande och Ficoll gradienter kan resultera i giftiga skador av öar⁸.

Det nuvarande protokollet bygger på den metod som beskrivs av Li et al.⁷, med ytterligare modifieringar som läggs till baserat på upplevelsen av oss själva^{och andra1,4}. De mest kritiska stegen i vårt protokoll är fastspänning av den gemensamma gallgången nära levern slutet, injicera kollagenase P via ampulla av Vater att smälta den exokrina vävnaden, och sedan använda en skakning vattenbad att påskynda matsmältningen mekaniskt^{1, 4,7}. Därefter används en "stopplösning" för att hämma ytterligare nedbrytning av kobbar. HBSS används för att tvätta bort kvarvarande kollagenase P-och stopplösning. När Ficoll-metoden användes för att rena humana öar rapporterades avkastningen vara dubbelt så stor som holarna med större funktionell förmåga (t. ex. insulinsekretion) jämfört med användning av Percoll-lutningar⁹. Studier har dock ifrågasatt användningen av Ficoll gradient på grund av dess toxiska effekt på holmar^1,10. Det har rapporterats att Histopaque gradient ger optimal rening kinetik för mus ö-isolering, som ger god avkastning av högkvalitativa öar med enklare steg och lägre kostnad¹. I vårt protokoll används Histopaque-1077 för att rena öar från annan kvarvarande vävnad^8,11. De skördade holarna kan odlas i komplett RPMI-1640 media, eller direkt utnyttjas i RNA/proteinkvantifiering.

Vårt protokoll, med hjälp av en kombination av kollagenase P matsmältningen och en enda gradient reningssteg, är enklare än andra publicerade protokoll. Vår metod kräver inte krävande kirurgiska ingrepp och har bara några enkla steg. Ännu viktigare är att detta protokoll konsekvent ger en bra avkastning av hög kvalitet funktionella öar (250-350/mus) som vi rapporterade¹².

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av djuromsorg och användning kommittén (ACUC) i Texas A & M University. De kirurgiska verktyg som behövs visas i figur 1 och Schematiskt diagram över proceduren visas i figur 2.

1. lösningar

1. Förbered Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS) genom att tillsätta 100 mL 10X HBSS (från lager) till 900 mL destillerat vatten för att tillverka 1 L HBSS (1X).
2. Förbered stopplösningen (måste göras fräsch och bör användas inom 1 h) genom att tillsätta 50 mL 100X fetalt bovint serum (FBS) till 450 mL iskallt 1X HBSS; Detta gör 500 mL stopplösning. Håll stopplösningen vid 4 ° c.
3. Bered kollagenase P-lösning (måste göras färskt inom 1 h för att användas) genom tillsats av 1 mg/mL kollagenas P till iskallt 1X HBSS. Använd 6 mL/mus.
   1. Tillsätt 0,05% (w/v) bovint serum albumin (BSA) till kollagenase P lösning (detta ger näringsämnen till de isolerade holarna). Använd till exempel 3 mg BSA i 6 mL kollagenase P-lösning. Håll på is.
   2. Beräkna och bered mängden kollagenase P som behövs för alla möss i 1 50 mL tub.
4. Förbered komplett RPMI 1640 medium genom att lägga till 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, INS-1 cell supplement (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat och 0,05 mM 2-merkaptoetanol) till 500 mL RPMI 1640 media som innehåller 5,5 mM glukos som skall användas för övernattning kultur och inkubering.

2. förberedelse

1. Fyll 3 50 mL rör med 25 mL RNase hämmande lösning, 70% etanol eller destillerat H₂O. Dessa lösningar kommer att användas för rengöring av kirurgiska verktyg före och under förfarandet.
2. Blötlägg tipsen av verktygen i RNase hämmande lösning för 30 min innan protokollet; Detta eliminerar alla potentiella RNase på verktyg.
3. Pre-cut absorberande kuddar till 6 i x 6 i storlek för användning under kirurgi.
4. Förbered 1X HBSS-lösning i förväg och förvara vid 4 ° c. Förbered stopplösningen före operationen. Förvaras vid 4 ° c.
5. Förbered kollagenase P lösning omedelbart före operationen och förvara på isen.
   Anmärkning: detta bör användas inom 2 timmar efter beredning.
6. Etikett 50 mL rör för matsmältning och rening; Förbered 2 rör för varje mus, en för matsmältningen och den andra för ö rening. Se till att djur-ID finns på båda rören.
7. Tillsätt 3 mL kollagenase P-lösning till det första 50 mL-röret. Resterande 3 mL kollagenase P kommer att injiceras.
8. Dra resterande 3 mL kollagenaslösning till en 3 mL spruta monterad med 30 G 1/2 i nålen. Placera sprutan på is.

3. förfarande

1. Ta bort alla verktyg från RNase hämmande lösning, sedan doppa dem först i röret med 70% etanol, sedan i röret som innehåller destillerat H₂O, sedan lufttorka på ren pappershandduk.
2. Placera musen i en kammare som innehåller 0,5 mL isofluran tills musen är djupt sövd.
3. Ta bort musen från kammaren och kontrollera tillstånd av anestesi genom att nypa en fot pad med pincett. Djup bedövningsmedel bygger på iakttagelsen att andningen blir stadigt långsam och musen är inerta till fots klämmande. Efter att ha bekräftat att musen är djupt sövda, euthanize musen med livmoderhalscancer dislokation, och sedan placera musen på den absorberande pad.
   1. Placera bedövande mus på magen, tillämpa tryck på halsen och flytta ryggraden från hjärnan genom att dra svansen.
4. Tejpa benen på musen i liggande läge till den absorberande pad, spraya kroppen med 70% etanol, och torka överskott av överflödig etanol.
5. Använd Cover glass pinps och böjda kirurgiska saxar att göra snitt. Först göra en horisontell snitt på huden i buken (~ 3 cm), dra huden vidöppen för att exponera bukväggen. Gör sedan en vertikal snitt (~ 3-4cm) på buken bukhinnan att fullt ut exponera bukspottkörteln i bukhålan (figur 3).
6. Skjut loberna i levern fint att exponera gallgången, det kommer att visas som en ljusrosa röret (figur 3).
7. Försiktigt flytta tarmen från höger ländryggen/iliaca regionen i bukhålan till höger, utsätta gallgången och leverartär (figur 3).
8. Spänn försiktigt den gemensamma gallgången med Schwartz Micro serraffines (figur 1) så nära levern som möjligt.
9. Identifiera ampulla av Vater, som ligger vid duodenalsår papilla, bildas av unionen av bukspottskörteln kanalen och gallgången. Den ampulla av Vater verkar svullna när de ses under en dissektion Mikroskop som är ingångspunkten till den gemensamma gallgången (figur 4).
   Obs: justera intensitet/vinkel av ljus i dissektion Mikroskop kan göra det lättare att lokalisera.
10. Sätt i sprutan med 3 mL av kollagenase P-lösningen i ampulla av Vater. Skjut nålen i kanalen för ca 1/4 av längden på gallgången (ampulla leder in i kanalen) som visas i figur 5.
11. När nålen är i ampulla, se till att orienteringen av nålen är sådan att det är parallellt med kanalen.
12. Stabilisera nålen genom att klämma fast med mikroadson-pincett för att förhindra att den punktera kanalen (figur 5).
13. Injicera långsamt och stadigt 3 mL av kollagenase P-lösningen från sprutan till gallgången (tillräckligt för att känna motstånd) som visas i figur 6. Målet är att skapa återflödet tryck för att tvinga kollagenase att komma in i bukspottskörteln kanalen. Injektion anses framgångsrik om huvud, nacke, kropp och svans regionen i bukspottkörteln är alla helt uppblåst.
    Obs: Holmen avkastning kommer att vara låg om antingen bukspottkörteln inte är helt uppblåst, eller mjälteområdet är inte helt uppblåst. Mjälten området innehåller det högsta antalet öar⁶. Inflationen kan bekräftas genom uppkomsten av öppna ytor mellan pankreasvävnad som är fyllda med lösning.
14. Försiktigt dissekera den uppblåsta bukspottkörteln och placera den i en 50 mL rötnings slang som innehåller 3 mL iskall kollagenase P lösning.
    1. Ta bort bukspottkörteln med 2 tång (böjda och mikro Adson; Se figur 1): (med början från mjälten, dra bukspottkörteln bort från mjälte och fortsätta ta bort från magen och längs tolvfingertarmen.
       Anmärkning: inga snitt krävs.
    2. Hacka bukspottkörteln för 3 – 5 s i rötnings röret med 3 mL iskall kollagenase P lösning med fin kirurgisk sax (figur 7a).
15. Säkra röret till ett rack i 37 ° c vattenbad och skaka vid 100 – 120 rpm i ca 12 – 13 min.
16. Efter inkubering, skaka försiktigt rören för hand för att störa vävnaden tills kollagenase P rötnings lösningen blir homogen (figur 7b). Homogenitet bekräftas av en sand-liknande utseende av fina partiklar i bukspottkörteln. Ungefär 30 s av mild handskakning är oftast tillräckligt. Håll röret upp till ljus för att undersöka om vävnaden är väl homogeniserad; skaka om för en annan ~ 15 s om det behövs.
17. När smält, omedelbart placera rören på isen och tillsätt 40 mL av iskall stopplösning för att avsluta enzymatisk matsmältningen.
    Anmärkning: vid denna punkt rötnings rör kan lämnas på is upp till 2 h, om arbetar på flera möss.
18. Centrifugera röret i en svängnings skopa centrifug vid 300 x g i 30 s (centrifugeringstemperaturen är flexibel).
    Anmärkning: Använd en svängig skopa centrifug så att vävnaden pelleten bildas på botten av 50 mL röret och inte på väggen av röret; Detta är avgörande för bättre ö-avkastning.
19. Dekantering och upprepa centrifugering med stopplösning 2 gånger, dekantering av lösningen efter varje spinn. Använd 20 mL stopplösning för varje efterföljande tvätt.
    1. Före varje spinn, stör pelleten genom att försiktigt skaka vävnaden pelleten i 50 mL röret i 20 mL stopplösning.
20. Återsuspendera vävnadpelleten med 40 mL iskall HBSS och centrifugera vid 300 x g i 30 s.
21. Dekantering och upprepa centrifugering med hjälp av en svängnings skopa centrifug med HBSS lösning två gånger, dekantering lösningen efter varje spinn. Använd 20 mL HBSS för varje tvätt.
    1. Före varje spinn, stör pelleten, för att lossa den från botten av röret genom att försiktigt skaka röret som innehåller 20 mL HBSS-lösning.
22. Efter den sista centrifugering bort alla HBSS.
23. Tillsätt sedan 5 mL rumstemperatur täthet gradient till 50 mL röret som innehåller pelleten. Vortex kort vid låg hastighet tills homogeniseras.
24. Tillsätt ytterligare 5 mL rums temperaturdensitetsgradient till 50 mL-röret. Vortexblanda inte.
    Obs: det är viktigt att förbli stadig och fortfarande så att bättre lutning för att bilda utan avbrott.
25. Pipettera 10 mL rumstemperatur HBSS-buffert i röret (med densitetsgradienten), droppe-för-droppe försiktigt och långsamt för att möjliggöra en gradient att bildas. Använd en pipett-pistol med en 10 mL pipett för att lägga HBSS dropwise.
26. Med hjälp av en svängnings skopa centrifug, spinn rör på 1700 x g i 15 min. se till att ändra hastigheten på både acceleration/retardation till den lägsta inställningen för att bibehålla lutningen (figur 7c).
27. Efter snurrande, ta försiktigt bort rören utan att störa lutningen. Med hjälp av en pipett pistol förfuktade med kallt HBSS (pipett HBSS upp och ner), Pipettera ut lagret av kobbar (5-10 mL) bildas mellan densitetsgradienten och HBSS i den nya 50 mL ö samling röret.
    Anmärkning: det är bra att blöta pipetten med kallt HBSS innan du pipetterar kobbar för att förhindra att holarna fastnar på pipettens innerväggar.
    1. Om separationen är ofullständig, skulle kobbar vara synliga i densitetsgradienten skiktet, Pipettera ut hela 10 mL av densitetsgradienten (bottenskikt) tillsammans med det ö-skikt som bildas vid gränssnittet (endast för att lämna ca 8-10 mL av HBSS översta lagret bakom).
       Obs: samla både ö-skiktet och densitetsgradienten skikt (bottenskikt) kan resultera i insamling av skräp som kan förlänga Holmen plock tid, men inga andra steg kommer att ändras. Att samla båda dessa skikt är inte nödvändigt när ö-skiktet är välformade.
28. Tillsätt 20 mL iskall HBSS till det nya 50 mL-röret som innehåller holkar, och centrifugera sedan på 350 x g i 3 minuter i en centrifug med svängig skopa.
29. Efter snurrande, Pipettera försiktigt (inte Dekantera) ut supernatanten (lämna ~ 3 ml längst ner) utan att störa pelleten som innehåller kobbar i botten. Kassera supernatanten.
30. Upprepa tvättning och centrifugering minst 3 gånger. Tillsätt 20 mL HBSS varje gång, och se till att suspendera pelleten före varje spinn.
31. Värm upp RPMI-1640 Complete Media-flaskan i ett vattenbad vid 37 ° c före användning. Efter den sista centrifugering, ta bort alla HBSS och tillsätt 4 mL av tidigare beredda kompletta RPMI-1640 media (innehållande FBS, INS-1 cell supplement och penicillin/streptomycin) till pelleten.
32. Dislodge pelleten genom att försiktigt snurra röret och omedelbart hälla RPMI-1640 media i en 100 mm petriskål. Tillsätt ytterligare 5 mL RPMI-1640-media till röret och snurra det försiktigt för att tvätta bort eventuella kvarvarande öar, häll sedan i mediet i samma petriskål.
    1. Under en dissekera Mikroskop, plocka friska öar från petriskål med hjälp av en 20 μL pipett, och Lägg dem i en ny petriskål som innehåller 10 mL komplett RPMI 1640 media. När de ses under en dissektion Mikroskop, bör holkar visas sfäriska/avlång och gyllenbrun färg med en slät yta jämfört med den relativt transparenta, stripig exokrina vävnad.
       Anmärkning: förstoring av dissektion Mikroskop är vanligtvis inställd på 12.5-16X. Holmen Yield kommer att variera beroende på olika faktorer, inklusive stam, ålder och kön av mus. Detta protokoll ger vanligtvis 250 – 350 friska öar från friska C57BL/6J mus ålder 4 – 10 månader gammal.
33. Inkubera kobbar i en steril inkubator vid 37 ° c med 5% CO₂ infusion och 95% befuktad luft över natten för experiment nästa dag, eller frysa kobbar för önskad analys vid ett senare tillfälle.
    1. När holarna är frysta, kan de inte användas för sekretion analyser, endast RNA eller protein kvantifiering. För att samla in celler att frysa, placera dem i HBSS buffert, samla alla öar i 200 – 500 μL buffert, överföring till 1,5 mL rör, Centrifugera 350 x g för 1 – 2 min, ta bort supernatanten lämnar inte mer än 30 – 40 μl lösning, placera i-20 ° c för korttidslagring ( flera dagar) eller-80 ° c för långtidsförvaring.

Representative Results

Korrekt slutförandet av detta förfarande kräver viss förståelse av mus anatomi i bukhålan. Detta möjliggör korrekt identifiering av ampulla av Vater och fastspänning av den gemensamma gallgången. Hela proceduren tar normalt 1 – 2 h. Det är effektivare att isolera öar från 4 – 6 möss samtidigt, så att flera prover kan centrifugeras tillsammans. Tiden för ö-plockning varierar beroende på antalet öar och effektiviteten i matsmältningen; Det kan ta ungefär en timme att plocka 250 – 350 öar från 1 mus.

I detta dokument ingår ett antal mycket realistiska bilder: figur 3 visar musens bukhålan, exponera gallgången och leverartären. Figur 4 visar hela längden av gallgången, som verkar vara en ljusare färg, liksom ampulla av Vater, som är större och glansigare nära tidpunkten (där nålen kommer att införas) mellan bukspottkörteln och tolvfingertarmen. En klämma placeras på den gemensamma gallgången och leverartär bunt nära levern att blockera flödet av kollagenase P i levern. Underlåtenhet att klämma gallgången korrekt eller tight nog kommer att resultera i läckage och ofullständig perfusion i bukspottkörteln. Figur 5 visar nålen insatt i ampulla av Vater i gallgången. När nålen är i den gemensamma kanalen, pincett används för att stabilisera nålen för att förhindra det från punktera kanalen medan injicera. När injektionen börjar, bukspottkörteln kommer att börja svälla från proximala änden till distala änden; mjälten-regionen bör börja blåsa efter ca 1 ml kollagenasinjektion. Tillbakaflöde i tarmen kan leda till en oönskad inflation i tolvfingertarmen; Detta kan åtgärdas genom att justera placeringen av nålen (dra ut lite, eller sätt tillbaka något djupare) och genom att korrekt stabilisera nålen med hjälp av tång. Injektionen anses vara en framgång om alla regioner i bukspottkörteln är uppblåsta (duodenal, gastric, och mjälten lober) som visas i figur 6. Avlägsnande av bukspottkörteln bör börja från mjälten regionen. Den uppblåsta bukspottkörteln hackas i bitar med fin kirurgisk sax (figur 7a). Efter 12 – 13 minuters nedbrytning och blandning genom handskakning förefaller den vävnads innehållande suspensionen vara mer homogen (figur 7b). Därefter renas holarna genom densitetsgradienten efter centrifugering. Figur 7C visar att ett holme-upphängnings skikt bildas mellan Hbss och densitetsgradienten efter centrifugering. Bra/hälsosamma öar framstår som släta rundformade; Bad/skadade öar visar ojämna kanter, och osmält exokrina vävnad visar oregelbunden form och verkar mer genomskinlig som visas i figur 8.

Figur 1: kirurgiska verktyg.
Böjda kirurgiska saxar, täck glas pinps, Micro Adson pinmett, böjda pinps, små kirurgiska sax, och Schwartz Micro serraffines (Microvascular Clamp) visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Schematisk illustration av protokollet.
De mest kritiska stegen i detta förfarande är fastspänningen av gallgången nära levern, och injicera kollagenase P via ampulla av Vater i gallgången för att smälta bukspottkörteln. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: placering av gallgången.
Forceps hålla upp den gemensamma gallgången och leverartär bunt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: illustration av gallgången och ampulla av Vater.
En klämma placeras på den gemensamma gallgången och leverartär bunt nära levern. De svarta pilarna pekar på ampulla av Vater där nålen kommer att införas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: kanylering av gallgången.
Efter ordentlig kanylering av gallgången, ampulla av Vater injiceras med trypan blå (för demonstration syfte endast) att bättre betona placeringen av den gemensamma gallgången. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: fullt uppblåst bukspottkörtel.
Den streckade linjen visar gränsen för den fullt parfymera bukspottkörteln. Pinkoppar håller upp mjälten regionen där holarna är mest koncentrerade. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 7: ö-isolering och reningssteg.
(A) mekaniskt hackade vävnad bitar av bukspottkörteln före matsmältningen. (B) smält bukspottkörteln – homogen vävnad suspension av kollagenas-parfymerad bukspottkörteln efter 13 min av inkubering i ett skakande vattenbad vid 37 ° c, följt av 30 s blandning för hand. C) ö suspensions skikt bildas mellan Hbss och densitetsgradienten efter centrifugering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: representativa ö-bilder från Fluorescenscell-Imager.
(A) goda kobbar, dåliga öar och exokrina vävnader ses. (B) ett kluster av goda öar visas. (C) panelen visar osmält exokrina vävnad bifogas en god holme. Bra/hälsosamma öar visar släta runda kanter, som indikeras av det röda bokstaven "G"; Bad/skadade öar visar oregelbunden form och ojämna kanter, och indikeras med blå bokstaven "B". Osmält exokrina vävnader framstår som genomskinliga, ofta knutna till kobbar, och indikeras med gröna bokstaven "E". Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta protokoll omfattar kollagenas perfusion och matsmältning, följt av rening av kobbar. De mest kritiska stegen i detta protokoll är effektiv injektion och fullständig perfusion av bukspottkörteln^1,4,7. Leveransmetoden för detta protokoll tillåter enzymet att korsa de anatomiska rutterna för att bättre smälta den exokrina vävnaden som omger holmar¹. Dessutom är denna teknik väl lämpad för fullständig nedbrytning av mjälten regionen, som har den högsta koncentrationen av öar^4,6. Detta protokoll, med välkontrollerad digestionstid och omsorgsfullt utförda reningssteg, kan producera 250 – 350 friska öar. De öar som isolerats från detta protokoll har använts framgångsrikt för att studera glukos-stimulerad insulinsekretion ex vivo¹². Från vår erfarenhet, insulinsekretion ökade 4-faldigt vid hög glukos stimulering (22,2 mM) jämfört med baseline (3,3 mM) efter natten inkubering i 5,5 mM glukos-innehållande RPMI-1640 komplett media. Överlevnadsförmågan/funktionaliteten hos öarna under långvarig inkubation (2 – 7 dagar) har inte testats.

Även om det presenterade protokollet innehåller detaljerade anteckningar och visuella demonstrationer, behövs vissa justeringar för att uppnå optimala förhållanden för hög avkastning och högkvalitativa öar. Två vanligaste problem som kan hindra framgången är felaktig kanylering av ampulla av Vater eller oavsiktlig punktering av kanalen. För att undvika dessa, bör man se till att platsen för penetration är just där ampulla möter tolvfingertarmen. Detta område är större och relativt lätt att identifiera, vilket möjliggör flera punkteringar utan att allvarligt äventyra integriteten i kanalen. En gång inom ampulla, bör orienteringen av nålen vara parallellt med kanalen snarare än vinklad. Vid denna punkt, tryck in nålen i kanalen för ca 1/4 av kanalens längd, och sedan stabilisera nålen med tång medan långsamt injicera kollagenase; Detta kommer att bidra till att förhindra nålen från att böja under trycket och oavsiktligt punktera kanalen. Andra problem kan omfatta över-eller under-nedbrytning av bukspottkörteln; Detta kan kräva modifiering baserat på ålder, stam och kön av möss. Skadade öar på grund av överrötning (enzymatisk och mekanisk) eller långvarig exponering för densitetsgradienten kan förekomma. Detta är vanliga problem som finns för liknande metoder; vissa smärre justeringar bör ge betydande förbättringar. Ett förslag när man hanterar dessa typer av frågor är att välja en variabel att ändra i taget (t. ex. tid för matsmältningen eller koncentrationen av kollagenase).

Den största fördelen med detta protokoll är vägen för enzym leverans: med kollagenase P att direkt smälta den exokrina bukspottkörteln med hjälp av en lättare anatomisk väg som ökar matsmältningen effektivitet¹. Denna metod har rapporterats att ge en 50% ökning av antalet öar jämfört med metoden för excising bukspottkörteln, hugga den, och utsätta den för kollagenas¹³. Detta protokoll kräver endast användning av en enda densitet lutning, vilket gör det betydligt mindre arbetsintensiva och mer kostnadseffektivt, jämfört med andra metoder som kräver beredning av flera gradienter på olika densiteter, eller den komplexa Percoll metod som kräver extra tid^1,8,11. Den gradientmetod som används i detta protokoll har också använts i ö-isolering av andra⁴. Denna metod för Holmen isolering ger vetenskapsmannen med ett förbättrat verktyg för att studera pankreasöar. Framtida tillämpningar av detta protokoll inkluderar förändring för att öka effekten när det handlar om diabetiker möss. Som gör et al. har observerat, diabetiska möss, beroende på glukosnivåer, ger färre kobbar (mindre än 100), med minskad storlek och utseende av öar⁴. Vi har observerat detta fenomen och tror att diabetiska öar är mer sårbara för enzymatisk och mekanisk nedbrytning som kräver särskild omsorg. Dessutom kan holdensitet ändra sitt utseende i densitetsgradienten, ytterligare optimering av protokollet skulle bidra till att öka avkastningen av diabetiska öar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL syringe	BD	309657	Hoding collagenase P
Coverglass forceps	VWR	82027-396	Holding skin of mouse to aid incision procedure
Curved forceps	Sigma-Aldrich	Z168696	Holding tissues during pancreas removal
Isoflurane	Piramal	B13B16A	To anaesthetize mice prior surgery
100 mm petri dishes	VWR	30-2041	Used for islet culture
30 G. ½ inch needle	BD	305106	For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs
50ml tube	VWR	89039-658	Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets
Absorbent pads with waterproof moisture barrier	VWR	82020-845	To absorb blood from syurgical procesdudes
Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability	Eppendorf	5811FJ478114	Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.
Collagenase P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	For digestion of exocrine pancreas
Curved surgical scissors	Fisher-Scientific	13-804-21	For cutting open mouse abdomen
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas
Hank's Balanced Salt Solution 10x	Corning	20-023-CV	Washing cells
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	For gradient formation
Light source	Leeds	LR92240	Enhancing visibility of microscope
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	For removing RNase
RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine	Corning	15-040-CV	Culturing Islets
Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)	Fine Science Tools	18052-01	Clamping common bile duct and hepatic artery
Shaking waterbath	Boekel/Grant	8R0534008	Important for mechanical digestion of exocrine tissue
Small surgical scissors	VWR	82027-578	Cuttitng tissue that atached to pancreas