С высоким разрешением Respirometry для измерения митохондриальной функции нетронутыми бета-клеток в присутствии природных соединений
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в измерить влияние глюкозы опосредованной изменений митохондриального дыхания, в присутствии природных соединений на нетронутыми 832/13 бета-клеток с высоким разрешением respirometry.
Abstract
С высоким разрешением respirometry позволяет для измерения потребления кислорода изолированных митохондриях, клеток и тканей. Бета-клетки играют решающую роль в организме путем контроля уровня глюкозы в крови через секреции инсулина в ответ на глюкозы в повышенных концентрациях. Секреции инсулина контролируется митохондриальное дыхание и метаболизм глюкозы. Таким образом измерения нетронутыми бета клеточного дыхания необходимо иметь возможность улучшить функции бета клеток для лечения диабета. С помощью нетронутыми 832/13 INS-1 производные бета-клеток, мы можем измерить эффект увеличения концентрации глюкозы на клеточное дыхание. Этот протокол позволяет нам оценить бета клеточного дыхания в наличие или отсутствие различных соединений, позволяя определить эффект дано соединений на нетронутыми клеточного дыхания. Здесь мы продемонстрировать эффект двух естественных соединений, мономерных эпикатехин и куркумин, на бета клеточного дыхания при наличии низких (2,5 мм) или высокой глюкозы (16,7 мм) условий. Этот метод может использоваться для определения влияния различных соединений нетронутыми бета клеточного дыхания, в присутствии различных концентраций глюкозы.
Introduction
Основная цель бета клеток поджелудочной железы является для поддержания системы нормогликемия через инсулина глюкоза стимулирует секрецию. Бета-клетки смысле физиологические изменения в распространении глюкозы в основном из-за низкого сродства высокой мощности транспортера глюкозы GLUT2 (глюкозы Transporter 2 Km 16,7 мм)1. С ростом уровня кровообращения глюкозы, этот перевозчик низкого сродства высокой емкости способствует пропорциональному увеличению внутриклеточных глюкозы в пределах бета клеток. Глюкоза метаболизируется путем гликолиза, цикла TCA (Цикл трикарбоновых кислот) и митохондриальное дыхание, что приводит к повышенной сотовой ATP (аденозинтрифосфата) уровнях. Повышенные концентрации ATP блокирует АТФ каналы чувствительных K+ , что приводит к деполяризации мембраны. Деполяризации мембраны вызывает открытие отстробировало Ca2 + каналов и последующее освобождение пузырьков связан инсулина гранул2. Дисфункция бета клеток является отличительной чертой диабета типа 2 (T2D) и приводит к секреции инсулина снизилась и плохо контролируемых и, в конечном счете, смерть клетки бета3. Механизмы, которые поддерживают или улучшить функцию бета клеток может использоваться в качестве лечения для T2D.
Исследования показали благотворное влияние естественных растительных соединений на поджелудочной железы клетки бета4. Эти соединения могут иметь их эффект через повышение бета пролиферации, выживания или секреции инсулина глюкоза стимулирует. Например недавние исследования показали, что мономерных epicatechin повышает секрецию инсулина глюкоза стимулируется путем увеличения митохондриальное дыхание и увеличение сотовой СПС уровнях5. Поэтому, понимая, как эти соединения могут увеличить функциональных бета клеток масса имеет важное значение для мобилизации этих соединений как потенциальные терапии.
Клеточное дыхание может быть измерена через ряд инструментов. Использование высокого разрешения респирометра позволяет для титрования химических Модуляторы для permeabilized или нетронутым клеток населения6. Этот инструмент позволяет добавление различных соединений, в различных концентрациях, таким образом давая широкий спектр информации.
Учитывая близкую связь между метаболизма глюкозы и функции бета клеток, размеры клеточного дыхания имеют решающее значение. Измерения клеточного дыхания может быть сделано с permeabilized или нетронутыми бета-клеток, каждая из которых имеет свой собственный набор преимуществ и недостатков7,8. Хотя permeabilization бета-клеток позволяет измерять различные аспекты электрон-транспортной цепи, она делает это без отношении механизм для стимулирования дыхания в бета ячейки, поглощение глюкозы и метаболизм. Таким образом использование unpermeabilized бета клеточного дыхания является очень полезным методом для определения бета-клеток ответ на различные уровни глюкозы, используя потребление кислорода как индикация.
Этот метод предназначен для измерения потребления кислорода в нетронутыми INS-1 производные 832/13 бета-клеток. Эта техника позволяет нам определить ответ бета-клеток в условиях unstimulatory глюкозы (2,5 мм глюкозы) а также условия стимулирующей глюкозы (16,7 мм глюкозы). В то время как unpermeabilized клетки не позволяет индивидуально проверить комплекс I, II или III электрона транспортной цепи, технику разрешения измерений, занимающихся сложными IV ингибирование (Oligomycin A), расцеплено дыхания (FCCP-карбонильных цианид- 4– phenylhydrazone (trifluoromethoxy)) и полностью препятствует дыхания (Antimycin A). Это исследование показывает эффективность измерения дыхания в неприкосновенности unpermeabilized бета-клеток поджелудочной железы, а также влияние двух естественных соединений, мономерных эпикатехин и куркумин, на бета клеточного дыхания.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель настоящего Протокола заключается в использовании с высоким разрешением respirometry для измерения дыхания ставки в нетронутыми бета-клеток поджелудочной железы. Этот метод позволяет измерение бета клеток ответ на увеличение глюкозы. Протокол также позволяет для пре?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить членов Tessem и Хэнкок лабораторий для помощника и научной дискуссии. Авторы благодарят Эндрю Neilson, PhD (Virginia Tech) за предоставление какао эпикатехин производных мономера дроби. Это исследование было поддержано грант от действий исследования диабета и Фонд образования для JST.
Materials
| O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
| DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
| INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
| Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
| Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
| Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
| Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
| NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
| D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
| 35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
| 200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
| Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
| FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
| Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
| BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |
Riferimenti
- Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
- Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
- Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
- Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
- Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
- Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
- Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
- Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
- Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
- Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
- Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
- Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
- Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
- Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
- Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
- Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
- Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).
