该协议的目的是测量葡萄糖介导的变化对线粒体呼吸的影响, 在天然化合物的存在, 在完整的832/13 β细胞使用高分辨率呼吸。
高分辨率呼吸允许测量分离的线粒体、细胞和组织的耗氧量。β细胞通过控制血糖水平, 通过胰岛素分泌来调节血糖浓度, 从而在体内发挥关键作用。胰岛素分泌受葡萄糖代谢和线粒体呼吸的控制。因此, 测量完整的β细胞呼吸是必不可少的, 以提高β细胞功能作为治疗糖尿病。使用完整的 832/13 INS-1 衍生的β细胞, 我们可以测量增加葡萄糖浓度对细胞呼吸的影响。这个协议允许我们测量β细胞呼吸在存在或没有各种各样的化合物, 允许一个确定特定化合物的作用在原封细胞呼吸。在这里, 我们展示了两种自然发生的化合物, 单体儿茶和姜黄素, 对β细胞呼吸在低 (2.5 毫米) 或高糖 (16.7 毫米) 条件下的作用。这种技术可以用来确定不同的化合物对完整的β细胞呼吸在不同的葡萄糖浓度存在的影响。
胰β细胞的主要目的是维持系统血糖通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌。β细胞感觉循环葡萄糖的生理变化主要归结于低亲和力, 高容量葡萄糖转运器 GLUT2 (葡萄糖运输者 2, Km 16.7 毫米)1。随着循环葡萄糖水平的升高, 这种高容量低亲和力转运体促进了β细胞内葡萄糖的比例增加。葡萄糖通过糖酵解、TCA 循环 (三酸循环) 和线粒体呼吸导致细胞 ATP (三磷酸腺苷) 水平的升高而代谢。atp 浓度升高会阻止 atp 敏感的 K+通道, 从而导致膜去极化。膜去极化导致电压门控 Ca 的开放2 +通道和随后释放囊泡胰岛素颗粒2。β细胞功能障碍是2型糖尿病 (T2D) 的标志, 其结果是减少和控制不良的胰岛素分泌和最终的β细胞死亡3。维持或改善β细胞功能的机制可用于治疗 T2D。
研究已经证明了自然发生的植物基化合物对胰腺β细胞4的有益作用。这些化合物可能通过增加β细胞增殖、存活或葡萄糖刺激的胰岛素分泌而产生作用。例如, 最近的研究表明, 单体儿茶通过增加线粒体呼吸和增加细胞 ATP 水平来增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌5。因此, 了解这些化合物如何能增加功能性β细胞质量, 是很重要的利用这些化合物作为潜在的疗法。
细胞呼吸可以通过一些工具来测量。使用高分辨率呼吸允许滴定化学调节剂到化或完整的细胞数量6。该工具允许在不同浓度下添加各种化合物, 从而提供广泛的信息。
鉴于葡萄糖代谢和β细胞功能之间的密切联系, 细胞呼吸的测量是至关重要的。细胞呼吸的测量可以使用化或完整的β细胞进行, 每一个都有自己的优缺点7,8。虽然β细胞的性允许人们测量电子传输链的不同方面, 但它不考虑在β细胞、葡萄糖摄取和新陈代谢中诱导呼吸的机制。因此, 使用 unpermeabilized β细胞呼吸是一种非常有用的技术来确定β细胞对各种葡萄糖水平的反应, 使用氧气消耗量作为读数。
该技术的目的是测量完整的 INS-1 832/13 β细胞的耗氧量。这项技术使我们能够确定β细胞对 unstimulatory 葡萄糖 (2.5 mm 葡萄糖) 的反应以及刺激葡萄糖条件 (16.7 毫米葡萄糖)。虽然 unpermeabilized 细胞不允许我们单独测试电子传输链的复杂 I、II 或 III, 但该技术允许测量复杂的 IV 抑制 (寡 A), 不耦合呼吸 (FCCP-羰基氰化物-4-三氟甲氧基腙), 完全抑制呼吸 (Antimycin A)。这项研究证明了测量呼吸在完整的 unpermeabilized 胰腺β细胞的功效, 以及两种自然发生的化合物, 单体儿茶和姜黄素对β细胞呼吸的影响。
本议定书的目的是使用高分辨率呼吸测量完整的胰β细胞的呼吸速率。这种方法允许测量β细胞的反应, 以增加葡萄糖水平。该协议还允许对各种化合物进行预处理, 如本协议所示, 与自然发生的单体儿茶或姜黄素4,5。与其他各种化合物的治疗可以用于本议定书, 与预处理 (如此处所示), 或通过对基本协议的最小修改在呼吸室内治疗…
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢 Tessem 和汉考克实验室的成员们进行了辅助和科学的讨论。作者感谢安德鲁尼尔逊博士 (弗吉尼亚理工学院) 提供可可衍生的儿茶单体分数。这项研究得到了来自糖尿病行动研究和教育基金会对 JST 的资助。
O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |