在天然化合物存在下测定完整β细胞线粒体功能的高分辨率呼吸
Summary
该协议的目的是测量葡萄糖介导的变化对线粒体呼吸的影响, 在天然化合物的存在, 在完整的832/13 β细胞使用高分辨率呼吸。
Abstract
高分辨率呼吸允许测量分离的线粒体、细胞和组织的耗氧量。β细胞通过控制血糖水平, 通过胰岛素分泌来调节血糖浓度, 从而在体内发挥关键作用。胰岛素分泌受葡萄糖代谢和线粒体呼吸的控制。因此, 测量完整的β细胞呼吸是必不可少的, 以提高β细胞功能作为治疗糖尿病。使用完整的 832/13 INS-1 衍生的β细胞, 我们可以测量增加葡萄糖浓度对细胞呼吸的影响。这个协议允许我们测量β细胞呼吸在存在或没有各种各样的化合物, 允许一个确定特定化合物的作用在原封细胞呼吸。在这里, 我们展示了两种自然发生的化合物, 单体儿茶和姜黄素, 对β细胞呼吸在低 (2.5 毫米) 或高糖 (16.7 毫米) 条件下的作用。这种技术可以用来确定不同的化合物对完整的β细胞呼吸在不同的葡萄糖浓度存在的影响。
Introduction
胰β细胞的主要目的是维持系统血糖通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌。β细胞感觉循环葡萄糖的生理变化主要归结于低亲和力, 高容量葡萄糖转运器 GLUT2 (葡萄糖运输者 2, Km 16.7 毫米)1。随着循环葡萄糖水平的升高, 这种高容量低亲和力转运体促进了β细胞内葡萄糖的比例增加。葡萄糖通过糖酵解、TCA 循环 (三酸循环) 和线粒体呼吸导致细胞 ATP (三磷酸腺苷) 水平的升高而代谢。atp 浓度升高会阻止 atp 敏感的 K+通道, 从而导致膜去极化。膜去极化导致电压门控 Ca 的开放2 +通道和随后释放囊泡胰岛素颗粒2。β细胞功能障碍是2型糖尿病 (T2D) 的标志, 其结果是减少和控制不良的胰岛素分泌和最终的β细胞死亡3。维持或改善β细胞功能的机制可用于治疗 T2D。
研究已经证明了自然发生的植物基化合物对胰腺β细胞4的有益作用。这些化合物可能通过增加β细胞增殖、存活或葡萄糖刺激的胰岛素分泌而产生作用。例如, 最近的研究表明, 单体儿茶通过增加线粒体呼吸和增加细胞 ATP 水平来增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌5。因此, 了解这些化合物如何能增加功能性β细胞质量, 是很重要的利用这些化合物作为潜在的疗法。
细胞呼吸可以通过一些工具来测量。使用高分辨率呼吸允许滴定化学调节剂到化或完整的细胞数量6。该工具允许在不同浓度下添加各种化合物, 从而提供广泛的信息。
鉴于葡萄糖代谢和β细胞功能之间的密切联系, 细胞呼吸的测量是至关重要的。细胞呼吸的测量可以使用化或完整的β细胞进行, 每一个都有自己的优缺点7,8。虽然β细胞的性允许人们测量电子传输链的不同方面, 但它不考虑在β细胞、葡萄糖摄取和新陈代谢中诱导呼吸的机制。因此, 使用 unpermeabilized β细胞呼吸是一种非常有用的技术来确定β细胞对各种葡萄糖水平的反应, 使用氧气消耗量作为读数。
该技术的目的是测量完整的 INS-1 832/13 β细胞的耗氧量。这项技术使我们能够确定β细胞对 unstimulatory 葡萄糖 (2.5 mm 葡萄糖) 的反应以及刺激葡萄糖条件 (16.7 毫米葡萄糖)。虽然 unpermeabilized 细胞不允许我们单独测试电子传输链的复杂 I、II 或 III, 但该技术允许测量复杂的 IV 抑制 (寡 A), 不耦合呼吸 (FCCP-羰基氰化物-4-三氟甲氧基腙), 完全抑制呼吸 (Antimycin A)。这项研究证明了测量呼吸在完整的 unpermeabilized 胰腺β细胞的功效, 以及两种自然发生的化合物, 单体儿茶和姜黄素对β细胞呼吸的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
本议定书的目的是使用高分辨率呼吸测量完整的胰β细胞的呼吸速率。这种方法允许测量β细胞的反应, 以增加葡萄糖水平。该协议还允许对各种化合物进行预处理, 如本协议所示, 与自然发生的单体儿茶或姜黄素4,5。与其他各种化合物的治疗可以用于本议定书, 与预处理 (如此处所示), 或通过对基本协议的最小修改在呼吸室内治疗…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢 Tessem 和汉考克实验室的成员们进行了辅助和科学的讨论。作者感谢安德鲁尼尔逊博士 (弗吉尼亚理工学院) 提供可可衍生的儿茶单体分数。这项研究得到了来自糖尿病行动研究和教育基金会对 JST 的资助。
Materials
| O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
| DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
| INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
| Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
| Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
| Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
| Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
| NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
| D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
| 35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
| 200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
| Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
| FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
| Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
| BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |
Riferimenti
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