والهدف من هذا البروتوكول لقياس تأثير التغييرات الجلوكوز بوساطة للتنفس المتقدرية حضور المركبات الطبيعية في خلايا بيتا سليمة 832/13 باستخدام ريسبيروميتري ذات الدقة العالية.
يسمح ريسبيروميتري عالية الدقة لقياس استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا المعزولة، والخلايا والأنسجة. خلايا بيتا تلعب دوراً حاسما في الجسم عن طريق ضبط مستويات السكر في الدم عن طريق إفراز الأنسولين استجابة لتركيزات مرتفعة من الجلوكوز. يتم التحكم في إفراز الأنسولين الجلوكوز الأيض والتنفس المتقدرية. ولذلك، قياس التنفس سليمة من خلايا بيتا ضروري لتكون قادرة على تحسين وظيفة خلايا بيتا كعلاج لمرض السكري. استخدام وظائف سليمة 832/13-1 اشتقاق خلايا بيتا يمكن أن نقيس تأثير على زيادة تركيز الجلوكوز في التنفس الخلوي. هذا البروتوكول يسمح لنا بقياس التنفس خلية بيتا في وجود أو عدم وجود مركبات مختلفة، مما يسمح أحد تحديد الأثر نظراً للمركبات في التنفس خلية سليمة. هنا علينا أن نظهر تأثير المركبين طبيعيا وأحادي يبيكاتيشين الكركمين، على التنفس خلية بيتا تحت الوجود منخفض (2.5 مم) أو ظروف ارتفاع الجلوكوز (16.7 مم). يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد تأثير المركبات المختلفة على تنفس خلايا بيتا سليمة وجود تركيزات الجلوكوز متباينة.
الغرض الأساسي لخلايا بيتا البنكرياس للحفاظ على نظام نورموجليسيميا عن طريق إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز. خلايا بيتا بمعنى التغييرات الفسيولوجية في تعميم الجلوكوز إلى حد كبير نظراً لتقارب منخفضة، عالية السعة الجلوكوز الناقل GLUT2 (الجلوكوز الناقل 2، كم 16.7 ملم)1. مع ارتفاع مستويات السكر الدورة الدموية، يسهل هذا الناقل تقارب منخفضة السعة العالية زيادة تناسبية في الجلوكوز داخل الخلية داخل الخلية بيتا. يتم استقلاب الجلوكوز عن طريق تحلل، ودورة TCA (دورة حمض تريكاربوكسيليك) والتنفس المتقدرية أسفر عن ارتفاع مستويات ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) الخلوية. أن تركيز ATP مرتفعة كتل قنوات ك+ الحساسة ATP، أسفر عن غشاء ديبولاريزيشن. Depolarization الغشاء يسبب فتح بوابات الجهد Ca2 + قنوات والإصدار التالي من حويصلة منضم الأنسولين حبيبات2. الخلل في خلايا بيتا هي السمة مميزة لمرض السكري من النوع 2 (T2D)، ويؤدي إلى إفراز الأنسولين انخفاض وضعف الرقابة، وفي نهاية المطاف موت الخلية بيتا3. يمكن استخدام آليات للمحافظة على أو تحسين وظيفة خلايا بيتا كعلاج ل T2D.
وقد أثبتت الدراسات الآثار المفيدة لتحدث بشكل طبيعي المركبات النباتية في البنكرياس من خلايا بيتا4. قد تكون هذه المركبات تأثيرها من خلال تزايد انتشار الخلايا بيتا، والبقاء على قيد الحياة، أو إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز. على سبيل مثال، أظهرت الدراسات الأخيرة أن يبيكاتيشين أحادي يعزز إفراز الجلوكوز-وحفز الأنسولين من خلال زيادة التنفس المتقدرية وزيادة ATP الخلوية المستويات5. ولذلك، فهم كيف يمكن زيادة هذه المركبات الوظيفية بيتا خلية الإعلام مهم للاستفادة من هذه المركبات كالمداواة المحتملة.
ويمكن قياس التنفس الخلوي من خلال عدد من الأدوات. يسمح استخدام ريسبيروميتير عالية الدقة لمعايرة المغيرون الكيميائية إلى سكان خلية سليمة أو بيرميبيليزيد6. تسمح هذه الأداة إضافة المركبات المختلفة، بتركيزات مختلفة، وبالتالي إعطاء مجموعة واسعة من المعلومات.
ونظرا للعلاقة الحميمة بين الجلوكوز الأيض ووظيفة خلايا بيتا، قياسات التنفس الخلوي الحاسمة. يمكن أن يتم قياس التنفس الخلوي باستخدام خلايا بيتا أما بيرميبيليزيد أو سليمة، مع كل منها مجموعتها الخاصة من مزايا وعيوب7،8. بينما بيرميبيليزيشن خلايا بيتا يسمح أحد لقياس الجوانب المختلفة من سلسلة نقل الإلكترون، يفعل ذلك دون ما يخص إليه لحفز التنفس في الخلية بيتا وامتصاص السكر والايض. ولذلك، استخدام التنفس خلايا بيتا أونبيرميبيليزيد تقنية مفيدة جداً لتحديد استجابة خلايا بيتا لمختلف مستويات السكر، استخدام استهلاك الأوكسجين قراءات.
والغرض من هذا الأسلوب لقياس استهلاك الأوكسجين في وظائف سليمة-1 اشتقاق خلايا بيتا 832/13. هذا الأسلوب يسمح لنا بتحديد استجابة خلايا بيتا لظروف الجلوكوز أونستيمولاتوري (2.5 ملم الجلوكوز) فضلا عن ظروف الجلوكوز تنشيطية (الجلوكوز 16.7 مم). بينما الخلايا أونبيرميبيليزيد لا تسمح لنا لاختبار فردي المجمع الأول أو الثاني أو الثالث من الإلكترون النقل سلسلة، التقنية تسمح مقاييس التعامل مع التنفس تثبيط (أوليجوميسين A)، فصل الرابع معقدة (فككب-الكربونيل السيانيد- 4-فينيلهيدرازوني (تريفلوروميثوكسي))، وتعوق التنفس (أنتيميسين A) تماما. وتوضح هذه الدراسة الكفاءة لقياس التنفس في خلايا بيتا البنكرياس أونبيرميبيليزيد سليمة، فضلا عن تأثير المركبين طبيعيا وأحادي يبيكاتيشين الكركمين، على التنفس خلايا بيتا.
والهدف من هذا البروتوكول استخدام ريسبيروميتري عالية الدقة لقياس معدلات الالتهاب الرئوي في خلايا بيتا البنكرياس سليمة. هذا الأسلوب يسمح بقياس استجابة خلايا بيتا لمستويات السكر زيادة. كما يسمح البروتوكول للمعالجة بالمركبات المختلفة، كما هو موضح في هذا البروتوكول بتحدث ?…
The authors have nothing to disclose.
المؤلف يود أن يشكر أعضاء مختبرات تسم وهانكوك لمساعد والمناقشة العلمية. يشكر المؤلفون أندرو نيلسون، دكتوراه (جامعة فرجينيا للتكنولوجيا) لتوفير جزء مركب يبيكاتيشين المشتقة الكاكاو. وأيد هذه الدراسة منحة من مؤسسة التعليم والسكري إجراء البحوث إلى JST.
O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |