זריחה zygotic השחזור לאחר הלבנת-צילום ןועברל ולגמישות כרומטין המאפשרת פיתוח מלא לטווח
Summary
כרומטין ולגמישות מופיע להיות מעורב הפוטנציאל ההתפתחותי של blastomeres. עם זאת, לא ידוע אם כרומטין ולגמישות יכול לשמש כאינדקס אמין עבור פוטנציאל התפתחותי של העוברים. . הנה, תואר מערכת ניסיונית שבה כרומטין הערכה ולגמישות מופרות יכולים לפתח את הקדנציה.
Abstract
הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה המאפשר הניתוח של האירועים המולקולריים המתרחשים במהלך ontogenesis. לאחרונה, ולגמישות כרומטין או פתיחות הוכח להיות מעורב בהם פוטנציאל התמיינות של תאי גזע עובריים pluripotent. בעבר דווח כי לעומת עם תאי גזע עובריים, מופרות הנמל מבנה מאוד התיר כרומטין, מציעה את השיוך שלו עם totipotency שלהם. עם זאת, עד עכשיו, זה לא טופלה אם זה מאוד התיר/פתיחה הכרומטין חשוב עבור עובריים פוטנציאל התפתחותי. במחקר הנוכחי, כדי לבדוק השערה זו, מערכת ניסויית ב אשר מופרות נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר הלבנת-צילום יכול לפתח למונח ללא נזק משמעותי פותחה. חשוב לציין, מערכת ניסויית זו צריך רק תנור פלייט-תרמוס בנוסף לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. ממצאי מחקר זה מראים מהגמילה פלורסצנטיות לאחר הלבנת-צילום ניתוח ניתוח (FRAP) יכול לשמש כדי לחקור האירועים המולקולריים כרומטין zygotic חשוב להתפתחות מלא לטווח.
Introduction
לאחר ההפריה, הכרומטין משתנה באופן דינמי, הכרומטין zygotic מכן הוקמה בסופו של דבר1,2. בתקופה זו, pronuclei אבהית, החלבון כרומטין דומיננטי משתנה מ-? מה לעזאזל קרה לתוך היסטון. כרומטין וכתוצאה מכך שונה מאוד מזו של תאי זרע, נקבה oocytes בכמה נקודות (למשל, הרכב משתנה היסטון, שינוי היסטון). לפיכך, בנוי כרומטין zygotic נחשב חשוב להתפתחות עוברית עוקבות. עם זאת, למרות המאמצים לחשוף את הפרטים של הכרומטין zygotic על פני תקופות ארוכות, שיטות להערכת איכות מופרות או לחזות את התפתחותם מלא לטווח בשלב אחד-תא על-ידי ניתוח שלהם הכרומטין. מעולם לא הייתי הקים.
במחקר הקודם, הוא גילה כי מופרות יש מבנה של כרומטין התיר מאוד3. כיום, ולגמישות כרומטין או פתיחות הוא האמין להיות גורם חשוב עבור פוטנציאל תאי גזע עובריים (ES)4התמיינות. ES תאים לא מוצג הומוגניות בטבע, אבל הם מעדיפים הטרוגניות; במושבות תא ES, כמה transiently רוכשים את פוטנציאל התמיינות גבוהה יותר דומה blastomeres של שני תאים בשלב עוברי. במהלך המעבר הזה לתוך התא-השני כמו המדינה, כרומטין ולגמישות ב ES תאים שינויים לתוך מה משולה עם שני תאים בשלב עוברי5. לפיכך, כרומטין ולגמישות נראה להיות חשוב עבור פוטנציאל התמיינות וזה אפשרי בהרחבה פתח כרומטין ב מופרות שימושית לצורך הערכת הפוטנציאל ההתפתחותי zygotic.
הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה המאפשר הניתוח של האירועים המולקולריים המתרחשים במהלך ontogenesis מכיוון ששיטה זו מאפשרת פיתוח עוקבות, אפילו מלא לטווח פיתוח6. בתור אחד של שיטות הדמיה בשידור חי, שימש FRAP ניתוח לבחון כרומטין ולגמישות של העוברים, ES תאים3,4,5. אם ניתן לנתח אותם ולגמישות כרומטין zygotic על ידי ניתוח FRAP ללא השפעה מזיקה על פיתוח מלא לטווח, זה עשוי להיות כלי רב ערך עבור הערכת איכות העוברים בשלב אחד-cell. עם זאת, ההשפעות על פיתוח מלא לטווח בשיטה ניסויית זו לא נבדקו. לאחרונה פותחה מערכת ניסויית באמצעות FRAP להעריך כרומטין zygotic ולגמישות. משום שזוהי מערכת תצפית חדשה עבור מופרות, זה היה כינה FRAP zygotic (zFRAP). zFRAP לא השפיעה באופן ביקורתי פיתוח מלא לטווח ומאז דווח במקום7. בדו ח זה, מתואר הפרוטוקול של שיטה ניסויית זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי גילה במחקר זה, הניתוח zFRAP אינו גורם נזק קריטי להתפתחות מלא לטווח, מציע שיטה זו הוא כלי מאוד שימושי כדי לחשוף את הקשר בין אירועים מולקולריים עובריים פוטנציאל התפתחותי. במהלך התיכנות לתוך התא-השני כמו מצב של תאים ES, שלפיו הפוטנציאל דיפרנציאלית של תאים אלה הופך גבוהה כמו זו של שני תאים בשלב…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Kishigami סטושי סאיאקה וואקאיאמה, Hiroaki Nagatomo, Kamimura סטושי, קאנה Kishida על מתן תגובות ביקורתיות ותמיכה טכנית. עבודה זו מומן בחלקו על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה התוכנית לקידום הרפורמה של האוניברסיטאות לאומי כדי הפעולה; החברה יפן לקידום המדע (16H 02593), אסדה למדע של קרן המדע טקדה כדי T.W. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
Riferimenti
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
