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Chimica

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Abstract

La incorporación genética de aminoácidos no-canónico (ncAAs) vía supresión de codón de parada ámbar es una técnica poderosa para instalar sondas artificiales y partes de reactivos a las proteínas directamente en la célula viva. Cada ncAA se incorpora por un dedicado par ortogonal de (AARS) supresor-tRNA/amino-acil-tRNA-sintetasa que es importado en el organismo del anfitrión. La eficacia de la incorporación de diferentes ncAAs grandemente puede diferir y ser insatisfactoria en algunos casos. Pares orthogonal pueden mejorarse mediante la manipulación de la AARS o el tRNA. Sin embargo, evolución dirigida de tRNA o AARS con grandes bibliotecas y métodos de selección muertos/vivos no son factibles en células de mamíferos. Aquí, se presenta un análisis basado en la fluorescencia fácil y robusto para evaluar la eficacia de pares orthogonal en células de mamíferos. El ensayo permite detección de decenas a cientos de variantes AARS/ARNt con un esfuerzo moderado y en un plazo razonable. Uso de este ensayo para generar nuevo tRNAs que mejoran significativamente el rendimiento del sistema ortogonal pyrrolysine es descrito, junto con la solicitud de ncAAs al estudio de la proteína G unida a receptores (GPCRs), que son un reto objetos por ncAA mutagénesis. En primer lugar, incorporando sistemáticamente un ncAA foto-reticulación a lo largo de la superficie extracelular de un receptor, sitios de unión de ligandos diferentes en el receptor intacto se asignan directamente en la célula viva. Segundo, mediante la incorporación de última generación ncAAs en un GPCR, ultrarrápido receptor catalizador-libre de etiquetado con un colorante fluorescente se demuestra, que explota bioorthogonal promovido por la tensión inversa del aliso de Diels cicloadición (SPIEDAC) en la célula viva. Como ncAAs puede aplicarse generalmente a cualquier proteína independientemente de su tamaño, el método es de interés general para un número de aplicaciones. Además, la incorporación de la ncAA no requiere ningún equipo especial y se realiza fácilmente en los laboratorios de bioquímica estándar.

Introduction

La incorporación genética de sondas químicas a las proteínas es un método poderoso para facilitar la investigación de los aspectos estructurales y dinámicos de la función de la proteína directamente en el contexto natural de la célula viva. Hoy en día, cientos de no-canónico aminoácidos (ncAAs) equipados con los más dispares grupos químicos pueden site-specifically incorporados a proteínas por biosíntesis1,2,3,4. Entre ellos, uno encuentra ncAAs fotosensibles tales como foto-reticulantes5, Foto enjaulado6,7,8,9 y foto conmutable aminoácidos10, 11, aminoácidos, teniendo tensas alquenos y alquinos para bioorthogonal libre de catalizador química2,12,13,14,15,16 ,17, aminoácidos con dansilo18, cumarina9,19y21 fluoróforos de prodan20,y aminoácidos equipados con otros sondeos biofísicas como así como con post traslacional modificaciones1,2,3,4,22,23,24,25.

La codificación genética de un ncAA está habilitada por una dedicada amino-acil-tRNA-sintetasa (AARS) junto a un cognado supresor-tRNA, que incorpora la ncAA en respuesta a un codón ámbar durante la síntesis ribosomal regular. pares de ncAARS/tRNA están diseñados para ser ortogonales en el organismo del anfitrión, es decir, no interferencia con los pares endógenos. La técnica está bien establecida tanto en hosts de procariotas y eucariotas y las células fácilmente aplicables a mamíferos. Pares para la incorporación de la ncAA en células de mamífero se basan en tres sistemas ortogonales principales: el sistema de Tirosil, que combina la TyrRS de e. coli26 con un supresor de Tirosil ámbar de B. stearothermophilus27 (CE TyrRS /Bstpar de ñame), la e. coli leucina sistema (CELeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 y el sistema de pyrrolysyl de archaeal (PylRS/tRNA Pyl par)3, por el que el tRNAPyl es un supresor natural de color ámbar. En general, cada ncAA es reconocido por un ncAARS especializado. Dependiendo de la estructura de la ncAA, la ncAARS se obtiene mediante evolución dirigida TyrRS, LeuRS o PylRS, aunque algunos sintetasas pueden aceptar más de un ncAA.

El par orthogonal se importa dentro de las células utilizando simplemente un vector plásmido. Más común y eficientes plásmidos son bicistronic y codifican para la sintetasa y el ARNt formando el par orthogonal29. Un segundo plásmido de codificación para la proteína de interés con un codón ámbar en el sitio señalado para la modificación es co transfected. La ncAA se agrega simplemente al medio de crecimiento de la célula. Sin embargo, diferentes grupos especializados utilizan diversas variantes del plásmido construcciones incluso para la incorporación de la ncAA mismo. Construcciones difieren en el arreglo de los genes en el vector, tipo de la sintetasa, uso del codón en el gene de la ligasa, uso de promotor, variante del tRNA y el número de casetes de expresión tRNA. Por otra parte, la eficacia de la incorporación de diferentes ncAAs puede variar drásticamente debido a la diferente eficacia catalítica de las sintetasas diferentes, la calidad de los tRNA y otros factores30. Por lo tanto, es importante disponer de un método rápido y confiable para evaluar la eficacia de un par orthogonal, elegir el sistema más adecuado para una aplicación deseada y realizar algunas medidas de optimización que mejoran la expresión de la proteína total rendimientos.

Hemos establecido un análisis simple y robusto basada en fluorescencia, para evaluar la eficiencia de pares orthogonal29 (figura 1). En el ensayo, las células son co transfected con el plásmido de codificación para el par orthogonal, junto con un plásmido de reportero bicistronic de codificación para la proteína verde fluorescente con un codón ámbar en una posición permisiva (EGFPetiqueta) y la mCherry gene. Fluorescencia roja y verde de Lisados celulares se leen en canales separados en un lector de placas en una placa de 96 pocillos. La intensidad de la fluorescencia verde se correlaciona directamente con la eficacia de la supresión de ámbar, mientras que la intensidad de fluorescencia roja da una estimación directa del tamaño de la muestra medida y la eficiencia de transfección. Con respecto a ensayos similares basados en fluorescencia celular asistida clasificación (FACS) leer31,32, el ensayo da una evaluación inmediata y completa de expresión de la proteína en la población de células enteras, que es más representativo de las condiciones experimentales usuales y ofrece una fácil adquisición de datos y procesamiento con software estándar. En general, la principal ventaja del ensayo es que un medio a un gran número de muestras puede analizarse en paralelo. Usando este análisis, hemos defendido una biblioteca racionalmente diseñada de supresor-tRNAs para mejorar la eficiencia de la Pyl sistema ortogonal30. Este trabajo describe el protocolo experimental para realizar este análisis y mostrar ejemplos de su aplicación, incluyendo la optimización del par ortogonal para la incorporación de la foto-reticulación ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) y la comparación de eficacia de la incorporación de aminoácidos diferentes (figura 2).

En los últimos años, herramientas de la ncAA se han demostrado muy potentes para investigar estructurales y aspectos funcionales de la proteína G acoplada a los receptores (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. en los seres humanos, GPCRs forman una gran familia de receptores de membrana (800 miembros) y representan los principales objetivos para las drogas terapéuticas. Caracterización directa de los GPCRs es todavía un reto y métodos bioquímicos complementarios son muy necesarios para su investigación. Hemos sido pionero en el uso de foto-reticulación ncAAs superficies GPCR y descubrir ligando vinculante bolsillos34. Utilizando nuestro sistema optimizado para la incorporación de Azi, incorporamos sistemáticamente Azi en todo el dominio del juxtamembrane entero de un GPCR directamente en células de mamífero vivo. Sobre la irradiación UV, Azi forma una especie de nitrene altamente reactivo que captura covalentemente moléculas vecinas. Cuando el ligando se agrega al sistema, Azi sirve como sonda de proximidad para revelar qué posiciones del receptor se acercan al ligand encuadernado. De esta manera, el modo de unión de la hormona neuropéptido Urocortin tipo I (Ucn1) en el receptor de la clase B GPCR corticotropin-lanzar-factor 1 (CRF1R)33 primero se dio a conocer. Últimamente, hemos revelado patrones de enlace distinto de agonistas y antagonistas sobre el receptor mismo38. Un enfoque similar se ha aplicado por otros orthosteric y sitios de Unión alostérica de otros péptidos y pequeñas moléculas ligandos de otros GPCRs39,40,41,42. Este manuscrito describe el protocolo experimental aplicado en nuestro laboratorio para la foto-reticulación asignación de superficies GPCR. El método es relativamente rápido, sencillo y no requiere ningún equipo especial, por lo que es aplicable en los laboratorios de bioquímica estándar. Lo importante es el enfoque proporciona una herramienta valiosa no sólo para identificar sitios de unión del ligando donde escasean los datos estructurales 3D, pero también para complementar en vitro los datos existentes con información de receptores completamente postraduccional modificados en el entorno fisiológico de la célula viva.

El reciente desarrollo de novela ncAAs cojinete en el lado cadena grupos químicos adecuados para la química ultrarrápida catalizador-libre bioorthogonal ha abierto la posibilidad de instalar fluoróforos de última generación para la proyección de imagen de súper-resolución en proteínas directamente en la vida de las células2,43. Tales anclajes químicos incluyen cyclooctyne filtrada en SCOK14, nonyne de bicyclo [6.1.0] en BCNK12,17y trans-cyclooctenes en TCO * K13,15,17 entre otros ncAAs albergar un norbornene16,17,44 o cyclopropene45,parte de la46 . NcAAs voluminosos para bioorthogonal química se incorporan por una variante de la PylRS generalmente se denota como PylRSAF (indicando que la mutación Y271A y Y349F en PylRS de Methanosarcina M. ), así como por otras ad hoc evolucionado ncAARSs17 , 44. las anclas de bioorthogonal reaccionan con reactivos de tetrazina47 través de cicloadición de Diels-Alder de demanda electrónica inversa para dar altos rendimientos Etiquetadoras dentro de unos minutos43,48. Sin embargo, aplicación de este enfoque poderoso sello GPCRs ha estado desafiando debido a una baja eficiencia global del sistema de incorporación de ncAA ortogonal. Utilizando nuestro sistema mejorado de Pyl, recientemente hemos demostrado alto rendimiento incorporación de tales aminoácidos GPCRs y ultrarrápida etiquetado GPCR en la superficie de células de mamífero vivo30. Receptores etiquetados fueron todavía funcionales, ya que fisiológicamente internalizado al activar el receptor con un agonista. El protocolo experimental para la incorporación de bioorthogonal anclajes en GPCRs y aquí se describen los siguientes pasos de etiquetado. Equipar a GPCRs con fluoróforos brillante pequeño, es el primer paso fundamental para el estudio de la dinámica estructural de GPCR en la célula viva mediante técnicas de microscopía avanzada.

Protocol

1. fluorescencia basada en la proyección de las eficiencias de incorporación (figura 1) Mantener las células HEK293 en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM; alta glucosa, glutamina 4 mM, piruvato) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C, 95% de humedad y 5% CO2. Las células de la semilla la transfección de víspera. Separar las células durante 5 minutos a 37 ° C e…

Representative Results

El contorno de la prueba de fluorescencia se representa en la figura 1. El ensayo se emplea en tres aplicaciones. En primer lugar, un número de variantes de tRNA para la incorporación de Lys(Boc) por el par de Pyl ortogonal es evaluado. Lys(BOC) es un aminoácido sterically similar a Pyl. Pyl no esté comercialmente disponible, Lys(Boc) se utiliza comúnmente como un substrato estándar para la PylRS. Los tRNAs seleccionados se basan en el tRNAPyl</sup…

Discussion

El protocolo describe un ensayo sencillo y fiable para evaluar la eficiencia de pares ortogonales para la incorporación de ncAAs proteínas expresadas en células de mamíferos. La principal ventaja de este método con respecto a ensayos ampliamente utilizados basado en FACS es que permite la realización simultánea y medición de un número mayor de muestras y proporciona datos que se analizan fácilmente utilizando un software normal. La disponibilidad de un método de mediano rendimiento para analizar pares orthogon…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo ha sido fundado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en subvenciones CO822/2-1 (programa de Noether del Premio Emmy) y CO822/3-1 a I.C.

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
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