JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Chimica

Optimering af den genetiske indarbejdelse af kemiske sonder ind i GPCRs til foto-crosslinking kortlægning og Bioorthogonal kemi i Live pattedyrceller

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

En letkøbt fluorescens assay er præsenteret for at evaluere effektiviteten af amino-acyl-tRNA-syntetase/tRNA par indarbejde ikke-kanoniske amino-syre (ncAAs) i proteiner udtrykt i pattedyrsceller. Anvendelsen af ncAAs til at studere G-protein koblede receptorer (GPCRs) er beskrevet, herunder foto-crosslinking kortlægning af bindende websteder og bioorthogonal GPCR mærkning på levende celler.

Abstract

Den genetiske indarbejdelse af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) via rav stop codon undertrykkelse er en kraftfuld teknik til at installere kunstige sonder og reaktive fraspaltning på proteiner direkte i den levende celle. Hver ncAA er indarbejdet i en dedikeret ortogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-syntetase (AARS) par, der importeres til værtsorganismen. Indarbejdelse effektiviteten af forskellige ncAAs kan variere, og være utilfredsstillende i nogle tilfælde. Ortogonale par kan forbedres ved at manipulere med enten de årlige aktivitetsrapporter eller tRNA. Styret evolution af tRNA eller AARS ved hjælp af store biblioteker og død/levende udvælgelsesmetoder er imidlertid ikke muligt i pattedyrsceller. Her præsenteres en letkøbt og robust fluorescens-baseret analyse til at evaluere effektiviteten af ortogonale par i pattedyrsceller. Analysen giver mulighed for screening snesevis til hundredvis af AARS/tRNA varianter med en moderat indsats og inden for en rimelig frist. Brug af denne analyse til at generere nye tRNAer, der væsentligt forbedrer effektiviteten af Pyrrolysin ortogonale system er beskrevet, samt anvendelse af ncAAs til studiet af G-protein koblede receptorer (GPCRs), som udfordrende objekter for ncAA mutagenese. Først, systematisk indarbejder en foto-crosslinking ncAA i hele den ekstracellulære overfladen af en receptor, bindingssteder af forskellige ligander på intakt receptoren er knyttet direkte i den levende celle. Anden, ved at indarbejde sidste generation ncAAs i en GPCR, ultrahurtig katalysator-fri receptor mærkning med et fluorescerende farvestof er demonstreret, som udnytter bioorthogonal stamme-forfremmet inverse Diels elletræ cycloaddition (SPIEDAC) på den levende celle. Som ncAAs kan anvendes generelt på et protein uafhængigt på sin størrelse, er metoden af almen interesse til en række applikationer. Derudover ncAA vedtægter kræver ikke nogen særligt udstyr og udføres nemt i standard biokemi labs.

Introduction

Den genetiske indarbejdelse af kemiske sonder i proteiner er en kraftfuld metode til at lette undersøgelsen af strukturelle og dynamiske aspekter af protein funktion direkte i naturlig forbindelse med den levende celle. I dag, kan hundredvis af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) udstyret med de mest forskelligartede kemiske grupper være site-specifically indarbejdet i proteiner af biosyntesen1,2,3,4. Mellem dem, man finder lysfølsomt ncAAs såsom foto-overfladebehandlingsvæsker5, foto-bur6,7,8,9 og foto-omstillelig aminosyrer10, 11, aminosyrer forsynet med anstrengte alkener og Alkyner for katalysator-fri bioorthogonal kemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyrer, der transporterer dansyl18, cumarin9,19og prodan20,21 fluorophores og aminosyrer udstyret med andre biofysiske sonder som godt som med post translationel ændringer1,2,3,4,22,23,24,25.

Den genetiske kodning af en ncAA er aktiveret af en dedikeret amino-acyl-tRNA-syntetase (AARS) parret til en beslægtet suppressor-tRNA, hvilke indlemmer ncAA som svar på en rav stop codon under den regelmæssige ribosomale syntese. ncAARS/tRNA par er konstrueret så den er ortogonale i værtsorganismen, dvs ikke cross-talk med de endogene par. Teknikken er veletableret både i prokaryote og eukaryote værter og let anvendelig til mammale celler. Par ncAA blandes i pattedyrceller er baseret på tre vigtigste ortogonale systemer: det tyrosyl system, der kombinerer TyrRS fra E. coli26 med en tyrosyl rav suppressor fra B. stearothermophilus27 (EF TyrRS /BstYam par), E. coli leucyl system (EFLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 , og archaeask pyrrolysyl system (PylRS/tRNA Pyl par)3, hvorved tRNAPyl er en naturlig rav suppressor. I almindelighed, er hver ncAA anerkendt af et specialiseret ncAARS. Afhængig af strukturen i ncAA opnås ncAARS via styret evolution af enten TyrRS, LeuRS eller PylRS, selv om nogle synthetases kan acceptere mere end én ncAA.

Ortogonale parret er importeret ind i cellerne ved blot at bruge et plasmid vektor. Mest almindelige og effektiv plasmider er bicistronic og indkode både for syntetase og tRNA danner ortogonale par29. En anden plasmid kodning for protein af rentebærende en rav codon på webstedet udpeget til ændring er co transfected. NcAA er simpelthen tilføjet til celle vækstmedium. Dog bruger forskellige specialiserede grupper ofte forskellige varianter af plasmid konstruktioner selv for indarbejdelse af den samme ncAA. Konstruerer forskellige arrangement af gener i vektor, type af syntetase, codon skik i syntetase gen, promoter skik, variant af tRNA og antallet af tRNA udtryk kassetter. Derudover kan indarbejdelse effektiviteten af forskellige ncAAs variere drastisk på grund af de forskellige synthetases, kvaliteten af tRNA, og andre faktorer30forskellige katalytisk effektivitet. Derfor er det vigtigt at have ved hånden en hurtig og pålidelig metode til at vurdere effektiviteten af en ortogonal par, både til at vælge den mest passende system for en ønskede program og til at udføre nogle optimering trin, der forbedrer samlede protein udtryk udbytter.

Vi har etableret en enkel og robust fluorescens-baseret analyse for at evaluere effektiviteten af ortogonale par29 (figur 1). I analysen, celler er co transfected med plasmid kodning for ortogonale parret sammen med en bicistronic reporter plasmid kodning både til den grønne fluorescerende proteiner forsynet med en rav stop codon på en eftergivende holdning (EGFPTAG) og den mCherry gen. Røde og grønne fluorescens af hele cellelysater læses i separate kanaler på en Pladelæser i en 96-brønd plade. Intensiteten af den grønne fluorescens direkte korrelerer med effektiviteten af rav undertrykkelse, der henviser til, at intensiteten af røde fluorescens giver et direkte estimat af størrelsen af den målte prøve og Transfektion effektivitet. Med hensyn til lignende assays baseret på fluorescens læse assisteret celle sortering (FACS) ud af31,32, analysen giver en øjeblikkelig og omfattende vurdering af protein udtryk i befolkningens hele cellen, som er mere repræsentant for sædvanlige forsøgsbetingelser, og byder på en lettere dataopsamling og behandling med standardsoftwaren. Samlet set er den største fordel af analysen, at et medie til et stort antal prøver kan analyseres parallelt. Ved hjælp af denne analyse, har vi screenet et rationelt designet bibliotek af suppressor-tRNAer til at forbedre effektiviteten af Pyl ortogonale system30. Dette arbejde beskriver forsøgsplan for at udføre denne analyse og vise eksempler på dens anvendelse, herunder optimering af ortogonale parret for indarbejdelse af den foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanin (Amalie) og sammenligning af indarbejdelse effektiviteten af forskellige aminosyrer (figur 2).

I de seneste år, ncAA værktøjer har vist sig meget kraftfuld at undersøge strukturelle og funktionelle aspekter af G-protein koblede receptorer (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. i mennesker, GPCRs udgør en stor familie af membranreceptorer (800 medlemmer) og repræsenterer vigtigste mål for terapeutiske lægemidler. Direkte strukturel karakterisering af GPCRs er stadig udfordrende og supplerende biokemiske metoder er meget nødvendige for deres undersøgelse. Vi har været banebrydende brug af foto-crosslinking ncAAs kort GPCR overflader og oplev ligand bindende lommer34. Ved hjælp af vores optimeret system til Azi indbygning, indarbejdet vi systematisk Azi i hele domænet hele juxtamembrane af en GPCR direkte i live pattedyrsceller. Ved UV-bestråling danner Azi en meget reaktive nitrene arter, der kovalent fanger nabo molekyler. Når liganden føjes til systemet, fungerer Azi som en nærhed sonde til at afsløre, hvilke holdninger af receptor kommer tæt på den bundne ligand. På denne måde blev tilstanden bindende neuropeptid hormon Urocortin I (Ucn1) på klasse B GPCR corticotropin-releasing-faktor receptor type 1 (CRF1R)33 først afsløret. Sidst, har vi offentliggjort særskilt bindende mønstre af agonister og antagonister på samme receptor38. En lignende fremgangsmåde er blevet anvendt af andre til at afsløre orthosteric og allosteriske bindingssteder andre peptider og lille molekyle ligander på andre GPCRs39,40,41,42. Dette manuskript beskriver forsøgsplan anvendes i vores lab for foto-crosslinking kortlægning af GPCR overflader. Metoden er relativt hurtigt, ligetil og kræver ikke nogen særligt udstyr, således at det kan anvendes i standard biokemi labs. Vigtigere er, tilgangen giver et værdifuldt redskab, ikke kun til at identificere ligand bindingssteder hvor 3D strukturelle data er sparsomme, men også at supplere eksisterende i vitro data med oplysninger fra fuldt post-translationally modificerede receptorer i den fysiologiske miljø af den levende celle.

Den seneste udvikling af nye ncAAs indflydelse på de side kæde kemiske grupper egnet til ultrahurtig katalysator-fri bioorthogonal kemi har åbnet op for muligheden for at installere sidste generation fluorophores for super-opløsning imaging i proteiner direkte på de levende celler2,43. Sådanne kemiske ankre omfatter anstrengte cyclooctyne i SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, og trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 blandt andre ncAAs husly en norbornene16,17,44 eller cyclopropene45,46 gruppe. Pladskrævende ncAAs i bioorthogonal kemi indgår med en variant af PylRS normalt betegnes som PylRSAF (med angivelse af mutation Y271A og Y349F i M. barkeri PylRS), samt af andre ad hoc- udviklet sig ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankre reagere med tetrazine reagenser47 via inverse elektron-demand Diels-elletræ cycloaddition at give høje mærkning udbytter inden for et par minutter43,48. Dog har anvendelsen af denne kraftfulde tilgang til label GPCRs udfordrende på grund af en lav samlede effektivitet af ortogonale ncAA indarbejdelse system. Bruge vores forbedrede Pyl system, har vi for nylig demonstreret højtydende indarbejdelse af sådanne aminosyrer i GPCRs og ultrahurtig GPCR mærkning på overfladen af levende pattedyrceller30. Mærket receptorer var stadig funktionel, som de fysiologisk internaliseret ved aktivering receptor med en agonist. Forsøgsplan for indarbejdelse af bioorthogonal ankre i GPCRs og de følgende mærkning trin er beskrevet her. Udstyre GPCRs med små lyse fluorophores er det første grundlæggende skridt mod studiet af GPCR strukturdynamik i den levende celle via avancerede mikroskopi-teknikker.

Protocol

1. fluorescens-baseret Screening af indarbejdelse effektivitetsfordele (figur 1) Opretholde HEK293 celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM; høje glukose, 4 mM glutamin, pyruvat) suppleret med 10% (v/v) føtal bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO2. Frø celler dagen før Transfektion. Frigør cellerne i 5 min ved 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS suppleret med 0,5 mM EDTA. Brug 1…

Representative Results

Omridset af fluorescens assay er afbildet i figur 1. Analysen er ansat i tre programmer. I første omgang, er en række tRNA varianter til indbygning af Lys(Boc) af Pyl ortogonale parret screenet. Lys(BOC) er en sterically svarende til Pyl aminosyre. Da Pyl ikke er kommercielt tilgængelige, er Lys(Boc) almindeligt anvendt som en standard substrat for PylRS. De screenede tRNAer er baseret på tRNAPyl. Hver tRNA variant bærer mutationer af enkelt b…

Discussion

Protokollen beskriver en simpel og pålidelig analyse til at vurdere effektiviteten af ortogonale par til indbygning af ncAAs i proteiner udtrykt i pattedyrsceller. Den største fordel ved denne metode i forbindelse med udbredte assays baseret på FACS er at det giver mulighed for samtidige forberedelse og måling af et større antal prøver, og indeholder data, der er let analyseret ved hjælp af en almindelig software. Tilgængeligheden af en medium-overførselshastighed metode til at analysere ortogonale par i pattedy…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde er blevet grundlagt af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under tilskud CO822/2-1 (Emmy-Noether program) og CO822/3-1 til IC

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochimica. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chimica. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

GPCRPhoto-crosslinkingBioorthogonal ChemistryNon-canonical Amino AcidsAmber Codon SuppressionFluorescence AssayMammalian CellsProtein-protein InteractionsLigand BindingLive Cell Imaging
check_url/it/57069?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image