JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chimica

Optimera genetiska införlivandet av kemiska sonder till varandra för foto-crosslinking kartläggning och Bioorthogonal kemi i levande däggdjursceller

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

En lättköpt fluorescens analysen presenteras för att bedöma effektiviteten av amino-acyl-tRNA-syntetas/tRNA par införliva icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) i proteiner som uttrycks i däggdjursceller. Tillämpningen av ncAAs att studera G-protein kopplade receptorer (varandra) beskrivs, inklusive foto-crosslinking kartläggning av bindande platser och bioorthogonal GPCR märkning på levande celler.

Abstract

Genetiska införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) via bärnsten stop kodon dämpning är en kraftfull teknik för att installera konstgjorda sonder och reaktiva delarna på proteiner direkt i den levande cellen. Varje ncAA införlivas genom en dedikerad ortogonala suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-syntetas (AARS) par som importeras in i värd organismen. Inkorporering effektivitet av olika ncAAs kan skilja sig, och vara otillfredsställande i vissa fall. Ortogonala par kan förbättras genom att manipulera de årliga verksamhetsrapporterna eller tRNAen. Dock riktad evolution av tRNA eller AARS använder stora bibliotek och döda/levande urvalsmetoder inte är genomförbara i däggdjursceller. Här presenteras en lättköpt och robust fluorescens-baserad analys att utvärdera effektiviteten i ortogonala par i däggdjursceller. Analysen kan screening tiotals till hundratals AARS/tRNA varianter med en måttlig ansträngning och inom rimlig tid. Användning av denna analys att generera nya tRNAs att avsevärt förbättrar effektiviteten i pyrrolysine ortogonala systemet beskrivs, tillsammans med tillämpning av ncAAs på studiet av G-protein kopplade receptorer (varandra), vilket är en utmaning objekt för ncAA mutagenes. Först, genom att systematiskt införliva en foto-crosslinking ncAA i hela extracellulära ytan av en receptor, bindande platser av olika ligander på intakt receptorn mappas direkt i den levande cellen. Andra, genom att införliva senaste generationens ncAAs i en GPCR, ultrasnabb katalysator-fri receptor märkning med ett fluorescerande färgämne demonstreras, som utnyttjar bioorthogonal stam-främjade inverse Diels-Alder cykloadditionen (SPIEDAC) på den levande cellen. Som ncAAs kan tillämpas generellt på något protein självständigt på dess storlek, är metoden av allmänt intresse för ett antal applikationer. Dessutom ncAA inkorporering kräver inte någon särskild utrustning och utförs enkelt i standard biokemi labs.

Introduction

Genetiska införlivandet av kemiska sonder i proteiner är en kraftfull metod för att underlätta utredningen av strukturella och dynamiska aspekterna av proteinfunktion direkt i det inhemska sammanhanget i den levande cellen. Nuförtiden, kan hundratals icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) utrustade med de mest olikartade kemiska grupperna anläggningsvis införlivas i proteiner av biosyntes1,2,3,4. Mellan dem, en finner ljuskänsliga ncAAs som foto-bindemedel5, Foto-bur6,7,8,9 och foto-omkopplingsbar aminosyror10, 11, aminosyror med ansträngda alkener och alkyner för katalysator-fri bioorthogonal kemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyror som transporterar dansyl18, kumarin9,19och prodan20,21 fluorophores och aminosyror som utrustade med övriga biofysiska sonder som väl som med post translationella modifieringar1,2,3,4,22,23,24,25.

Genetiska kodningen av en ncAA aktiveras som en dedikerad amino-acyl-tRNA-syntetas (AARS) ihopkopplade till en cognate suppressor-tRNA, vilken inlemmar ncAA som svar på en bärnstensfärgad stop kodon under regelbunden ribosomal syntesen. ncAARS/tRNA par är konstruerade så att de är ortogonala i värd organismen, dvs inte cross-talk med endogena paren. Tekniken är väl etablerade både i prokaryota och eukaryota värdar och enkelt tillämpas på däggdjurs celler. Par för ncAA inkorporering i däggdjursceller baseras på tre huvudsakliga ortogonalsystem: det tyrosyl systemet, som kombinerar TyrRS från E. coli26 med en tyrosyl bärnsten suppressor från B. stearothermophilus27 (EG TyrRS /BstYam par), i E. coli leucyl system (EGLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 och archaeal pyrrolysyl systemet (PylRS/tRNA Pyl par)3, whereby tRNAenPyl är en naturlig bärnsten suppressor. I allmänhet är varje ncAA erkänd av en specialiserad ncAARS. Beroende på ncAA struktur erhålls ncAARS genom riktad evolution av TyrRS, LeuRS eller PylRS, även om vissa synthetases kan acceptera mer än en ncAA.

Ortogonala paret importeras in i cellerna genom att bara använda en plasmid vektor. Mest gemensam och effektiv plasmider är bicistronic och koda både för kväveoxidsyntas och den tRNAen bildar den ortogonala par29. En andra plasmid kodning för proteinet av räntebärande en bärnstensfärgad kodon på den plats som utsetts för modifiering är samtidig transfekterade. NcAA är helt enkelt läggas till cell odlingsmedium. Dock använder olika specialiserade grupper ofta olika varianter av Plasmiden konstruktioner även för införlivandet av samma ncAA. Konstruktioner skiljer sig åt i arrangemanget av generna i vektor, typ av kväveoxidsyntas, kodon användning i kväveoxidsyntas genen, promotorn användning, variant av tRNA och antal tRNA uttryck kassetter. Dessutom kan införlivandet effektiviteten i olika ncAAs varierar drastiskt på grund av de olika synthetases, kvaliteten på tRNAen, och andra faktorer30olika katalytiska effektivitet. Därför är det viktigt att ha till hands en snabb och tillförlitlig metod för att bedöma effektiviteten av en ortogonal par, både att välja det lämpligaste systemet för ett önskat program och utföra vissa optimering steg som förbättrar övergripande proteinuttryck avkastning.

Vi har etablerat en enkel och robust fluorescens-baserad analys för att bedöma effektiviteten av ortogonala par29 (figur 1). I analysen, cellerna är samtidig transfekterade med plasmid kodning för rätvinkliga par, tillsammans med en bicistronic reporter plasmid kodning både för grönt fluorescerande protein med en bärnstensfärgad stop kodon vid en tillåtande position (andraTAG) och den mCherry gen. Röd och grön fluorescens av hela-cell lysates läses i separata kanaler på en tallrik läsare i en plattan med 96 brunnar. Intensiteten på den gröna fluorescensen korrelerar direkt med effektiviteten i bärnsten dämpning, medan intensiteten i röd fluorescens ger en direkt uppskattning av storleken på uppmätta provet och transfection effektivitet. Med avseende på liknande analyser baserat på fluorescens läsa assisterad cell sortering (FACS) upp31,32, analysen ger en omedelbar och omfattande bedömning av proteinuttryck i hela cellen befolkningen, som är mer representativa för vanliga experimentella förhållanden, och erbjuder en lättare datainsamling och bearbetning med standardprogramvara. Övergripande, den största fördelen med analysen är att ett medium till ett stort antal prover kan analyseras parallellt. Med denna analys, har vi ett rationellt designade bibliotek med suppressor-tRNAs att förbättra effektiviteten av Pyl ortogonala systemet30. Detta arbete beskriver det experimentellt protokollet för att utföra denna analys och visar exempel på sin ansökan, inklusive optimering av det ortogonala paret för införlivandet av den foto-crosslinking ncAA p-azid-L-fenylalanin (Azi) och jämförelse av inkorporering effektivitet av olika aminosyror (figur 2).

De senaste åren, ncAA verktyg har visat mycket kraftfullt att undersöka strukturella och funktionella aspekter av G-protein kopplade receptorer (varandra)33,34,35,36,37 , 38. i människor, varandra bildar en stor familj med membranreceptorer (800 medlemmar) och representerar huvudsakliga mål för terapeutiska läkemedel. Direkta strukturell karaktärisering av varandra är fortfarande utmanande och kompletterande biokemiska metoder behövs mycket för deras utredning. Vi har börjat använda sig av foto-crosslinking ncAAs att kartlägga GPCR ytor och upptäck ligand bindande fickor34. Använda vårt optimerade system för Azi iblandning, införlivas vi systematiskt Azi i hela domänen hela juxtamembrane av en GPCR direkt i levande däggdjursceller. Vid UV-bestrålning bildar Azi en mycket reaktiva nitrene arter som kovalent fångar närliggande molekyler. När liganden läggs till systemet, fungerar Azi som en närhet sond att avslöja vilka positioner av receptorn komma nära den bundna liganden. På detta sätt avtäcktes först bindande funktionsläget av neuropeptid hormonet Urocortin I (Ucn1) på klass B GPCR corticotropin-släppa-factor receptor typ 1 (CRF1R)33 . Nyligen, har vi lämnat ut distinkta bindande mönster av agonister och antagonister på samma receptor38. En liknande metod har tillämpats av andra att avslöja orthosteric och Alloster bindningsställen andra peptider och småmolekylära ligander på andra varandra39,40,41,42. Detta manuskript beskriver den experimentellt protokoll tillämpas i vårt labb för foto-crosslinking kartläggning av GPCR ytor. Metoden är relativt snabb och enkel och kräver inte någon särskild utrustning, så att den är tillämplig i standard biokemi labs. Allt metoden erbjuder ett värdefullt verktyg inte bara att identifiera liganden bindande platser där 3D grunddata är knappa, men också att komplettera befintliga in vitro- data med information från fullt post-translationally modifierade receptorer i den fysiologiska miljön i den levande cellen.

Den senaste utvecklingen av Roman ncAAs bär på side chain kemiska grupperna lämplig för ultrasnabb katalysator-fri bioorthogonal kemi har öppnat upp möjligheten att installera senaste generationens fluorophores för super-upplösning imaging i proteiner direkt på levande celler2,43. Sådana kemiska ankare inkluderar ansträngda cyclooctyne SCOK14, etylbicyklo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, och trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 bland andra ncAAs hysa en norbornen16,17,44 eller Otillagade45,46 biexponentiellt. Skrymmande ncAAs för bioorthogonal kemi införlivas genom en variant av den PylRS som brukar betecknas som PylRSAF (som anger mutation Y271A och Y349F i M. barkeri PylRS), as well as vid andra ad hoc- utvecklats ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankare reagerar med tetrazine reagens47 via omvänd elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen att ge märkning kickavkastningar inom några minuter43,48. Dock tillämpningen av denna kraftfulla metod till etiketten varandra har varit en utmaning på grund av en låg övergripande effektivitet ortogonala ncAA inkorporering. Med vår förbättrade Pyl-systemet, har vi nyligen visat hög avkastning införlivandet av sådana aminosyror i varandra och ultrasnabb GPCR märkning på ytan av levande däggdjursceller30. Märkt receptorer var fortfarande funktionella, som de internaliserat fysiologiskt vid aktivering av receptorn med en agonist. Det experimentella protokollet för införlivandet av bioorthogonal ankare i varandra och följande märkning steg beskrivs här. Förse varandra med små ljusa fluorophores är det första grundläggande steget mot studiet av GPCR strukturell dynamik i den levande cellen via avancerad mikroskopi tekniker.

Protocol

1. fluorescens-baserad Screening av inkorporering effektivitetsvinster (figur 1) Upprätthålla HEK293 celler i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM; hög glukos, 4 mM glutamin, pyruvat) kompletteras med 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin vid 37 ° C, 95% luftfuktighet och 5% CO2. Utsäde cellerna dagen innan transfection. Lossa cellerna för 5 min vid 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS kompletteras med 0…

Representative Results

Skissera av fluorescens analysen avbildas i figur 1. Analysen är anställd i tre program. I första hand undersöks ett antal tRNA varianter för inkorporering av Lys(Boc) av Pyl ortogonala paret. Lys(BOC) är en aminosyra som är koalisera liknar Pyl. Eftersom Pyl inte är kommersiellt tillgängliga, används ofta Lys(Boc) som standard substrat för PylRS. De kontrollerade tRNAsna är baserade på tRNAenPyl. Varje tRNA-variant bär mutationer av …

Discussion

Protokollet beskrivs ett enkelt och tillförlitligt test för att bedöma effektiviteten av ortogonala par för införlivandet av ncAAs i proteiner som uttrycks i däggdjursceller. Den största fördelen med denna metod i respekt till utbredda analyser baserat på FACS är att den tillåter samtidig beredning och mätning av större antal prover och ger data som analyseras enkelt med en vanlig programvara. Tillgången på en medium-genomströmning metod att analysera ortogonala par i däggdjursceller är mycket viktigt f…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete har grundats av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) under bidrag CO822/2-1 (Emmy-Noether program) och CO822/3-1 till I.C.

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochimica. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chimica. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

GPCRPhoto-crosslinkingBioorthogonal ChemistryNon-canonical Amino AcidsAmber Codon SuppressionFluorescence AssayMammalian CellsProtein-protein InteractionsLigand BindingLive Cell Imaging
check_url/it/57069?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image