Desarrollo de proteínas recombinantes para el tratamiento de dolor crónico
Summary
En este trabajo ofrecemos detalles de los métodos de producción y control de calidad de una proteína de fusión recombinante de IL4-10. También mostramos cómo probar la efectividad de esta proteína para resolver el dolor en un modelo murino de dolor inflamatorio.
Abstract
El dolor crónico es difícil de tratar y se necesitan urgentemente nuevos enfoques para resolver el dolor persistente. Citoquinas antiinflamatorias son candidatos prometedores para el tratamiento de afecciones debilitantes dolor debido a su capacidad para regular interacciones neuro-inmune aberrantes. Sin embargo, fisiológicamente funcionan en una red de varios cytokines, y por lo tanto su efecto terapéutico no puede ser óptimo cuando se utilizan como drogas independientes. Para superar esta limitación, hemos desarrollado una proteína de fusión de las citoquinas antiinflamatorias IL4 y IL10. Aquí, describimos los métodos de producción y control de calidad de la proteína de fusión recombinante de IL4-10 y probamos la eficacia de la proteína de la fusión de IL4-10 para resolver el dolor en un modelo murino de dolor inflamatorio persistente.
Introduction
Dolor crónico sigue siendo una de las más debilitantes y tratamiento problemas médicos del siglo XXI, que afecta a > 20% de la población adulta1,2. Sin embargo, los tratamientos para aliviar el dolor crónico son a menudo ineficaces o deben suspenderse debido a efectos secundarios graves3. Importante, actualmente fármacos disponibles sólo proporcionan alivio sintomático, pero no significativamente modificar o curar el dolor crónico. Aunque el dolor crónico parece ser un desorden neurológico, la evidencia sugiere la implicación del sistema inmune en el desarrollo de dolor crónico4,5. Por otra parte, están surgiendo enfoques inmune para tratar el dolor. Por ejemplo, citoquinas antiinflamatorias inhiben dolor en varios modelos de dolor crónico6,7,8. Sin embargo, citoquinas antiinflamatorias tienen una vida media corta, reduciendo sus efectos de inhibición de dolor. Por otra parte, citocinas antiinflamatorias más óptimo trabajan en concierto con los demás. Para superar estas limitaciones, hemos recientemente fusionados el antiinflamatorio cytokines interleukin-4 (IL4) y interleukin-10 (IL10) en una molécula. La proteína de la fusión de IL4-10 muestra una eficacia superior en la inhibición de dolor inflamatorio y neuropático crónico en comparación con el de citoquinas individuales9. Aquí describimos cómo se produce dicha proteína de fusión, purificados, y cómo se controla su calidad.
Proteína de la fusión de IL4-10 se produce en las células humanas por transitorios de la transfección de las células HEK293-F con un vector de expresión de pUPE llevando la secuencia de cDNA, codificación de la proteína de la fusión de IL4-10. Las células HEK293-F se eligen para permitir la modificación poste-de translación de la proteína, algo que no ocurre en sistemas de expresión bacteriana. Para optimizar glycan tapado con ácido siálico, cDNA codificación beta-galactósido-2, 3 sialil-transferasa se incorpora en el vector como un transgen segundo. La proteína de fusión se purifica mediante purificación de proteínas de afinidad de la cultura sobrenadante debido a que es más poderoso que la purificación por otros métodos por ejemplo tamaño de exclusión o cromatografía de intercambio iónico10,11. Para purificar la proteína de la fusión de IL4-10, que utilizamos en anticuerpos monoclonales hizo contra IL4. Evaluación de la pureza y la bioactividad de la proteína purificada de la fusión de IL4-10 se realizan como parte del control de calidad. Se evalúa la pureza de los lotes producidos por sodio dodecil sulfato poliacrilamida Gel electroforesis (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión de tamaño (HP-SEC) de alta presión. La bioactividad de la proteína de fusión de IL4-10 se evalúa midiendo su capacidad para inhibir el lipopolisacárido (LPS)-inducida por la producción de factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) en cultivos de sangre entera y que comparan la combinación de la persona cytokines.
Por último, para poner a prueba la capacidad de inhibir el dolor crónico IL4-10 de proteínas de fusión, se describe cómo la proteína de fusión puede ser probada como analgésico en modelos de ratón ampliamente utilizado del dolor inflamatorio persistente12,13,14 . Aquí describimos los métodos de un modelo de dolor inflamatorio. Sin embargo, es importante tener en cuenta que otros modelos de dolor puede ser utilizado (por ejemplo, modelos de dolor neuropático), dependiendo de la investigación las preguntas que necesitan ser contestadas. Para evaluar el dolor en estos modelos, es importante utilizar una gran variedad de medidas conductuales que incluyen evocadas y dolor no evocado. Aquí, hemos descrito los métodos de evaluación de cambios en las respuestas conductuales evocadas mecánicamente y termal. Sensibilidad mecánica a los estímulos inocuos se evaluó utilizando el test de Von Frey, mientras que la sensibilidad térmica se evaluó mediante la prueba de Hargreaves. Lo importante, no evocados hiperalgesia/alodinia se mide mediante la prueba dinámica peso teniendo. Estas medidas son ampliamente aceptadas como medidas de dolor y obtener información importante sobre los umbrales de dolor y posible dolor experimentado por los animales15,16,17. Otras medidas para evaluar el dolor evocado no (p. ej., independiente del estímulo), como el test de preferencia de lugar condicionada, puede ser valioso18. Para evaluar el potencial del fármaco para inhibir el dolor, se realizó la administración intratecal de la proteína de fusión, ya que con esta vía de administración menos dosis de proteína para llegar a las zonas relacionadas con el dolor y evitar sistémica (lado a) efectos19, 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito describe métodos para la producción y caracterización de un recombinante de la proteína de la fusión de IL4-10 y métodos para probar su eficacia en la inhibición de hiperalgesia inflamatoria en modelos de ratón de dolor inflamatorio persistente. La producción y purificación de la proteína de fusión de IL4-10 se realiza en pequeña escala. Se seleccionan las células HEK293 como sistema de expresión para la producción de proteína porque permiten modificaciones post-traduccionales que no pued…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parte de este trabajo ha sido financiado por una ciencias biológicas de la Universidad de Utrecht conceda
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
Riferimenti
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