Ontwikkeling van recombinante eiwitten voor de behandeling van chronische pijn
Summary
In deze paper we nadere bijzonderheden te geven voor de wijze van productie en kwaliteitscontrole van een IL4-10 recombinante fusieproteïne. Ook laten we zien hoe te testen van de effectiviteit van dit eiwit op te lossen in een muismodel van inflammatoire pijn pijn.
Abstract
Chronische pijn is moeilijk te behandelen en nieuwe benaderingen voor het oplossen van aanhoudende pijn zijn dringend noodzakelijk. Anti-inflammatoire cytokines zijn veelbelovende kandidaten voor de behandeling van invaliderende pijn omstandigheden als gevolg van hun capaciteit voor het regelen van afwijkende neuro-immuun-interacties. Echter fysiologisch ze werken in een netwerk van verschillende cytokines en hun therapeutisch effect kan niet dus optimaal wanneer gebruikt als zelfstandige drugs. Om deze beperking ondervangen, ontwikkelden we een fusieproteïne van de anti-inflammatoire cytokinen, IL4 en IL10. Hier beschrijven we de methoden voor productie en kwaliteitscontrole van IL4-10 recombinante fusieproteïne en testen we de doeltreffendheid van de IL4-10 fusieproteïne te lossen pijn in een muismodel van aanhoudende inflammatoire pijn.
Introduction
Chronische pijn blijft een van de meest slopende en onder behandelde medische problemen van de 21e eeuw, beïnvloeden > 20% van de volwassen bevolking1,2. Echter behandelingen te verstrekken verlichting van chronische pijn zijn vaak ineffectief of moeten worden stopgezet vanwege ernstige bijwerkingen3. Nog belangrijker is, momenteel beschikbaar drugs alleen symptomatische verlichting, maar niet aanzienlijk wijzigen of genezen van chronische pijn. Hoewel chronische pijn lijkt te zijn van een neurologische stoornis, blijkt betrokkenheid van het immuunsysteem in chronische pijn ontwikkeling4,5. Bovendien ontstaan er immuun-gebaseerde benaderingen voor de behandeling van pijn. Anti-inflammatoire cytokinen remmen bijvoorbeeld pijn in verschillende modellen van chronische pijn6,7,8. Anti-inflammatoire cytokines hebben echter een korte halveringstijd, verminderen van hun potentiële pijn-remmende effecten. Bovendien werken anti-inflammatoire cytokines meest optimaal in concert met elkaar. Deze beperkingen wilt opheffen, gesmolten we onlangs de anti-inflammatoire cytokines Interleukine-4 (IL4) en interleukine-10 (IL10) in een molecuul. De IL4-10-fusieproteïne toont superieure werkzaamheid in het remmen van chronische inflammatoire en neuropathische pijn ten opzichte van de individuele cytokines9. Hier beschrijven we hoe dergelijke fusieproteïne wordt geproduceerd, gezuiverd, en hoe de kwaliteit wordt gecontroleerd.
IL4-10 fusieproteïne is geproduceerd in menselijke cellen door voorbijgaande transfectie van HEK293-F cellen met een pUPE meningsuiting vector die de volgorde van de cDNA codering van de IL4-10-fusieproteïne. HEK293-F cellen worden gekozen dat voor de posttranslationele wijziging van het eiwit, iets dat niet in bacteriële expressiesystemen gebeurt. Voor het optimaliseren van glycan aftopping met sialic zuur, cDNA codering van bèta-galactoside-2, wordt 3-sialyl-transferase opgenomen in de vector als een tweede transgenic. De fusieproteïne wordt gezuiverd gebruik eiwitreiniging affiniteit van het supernatant cultuur aangezien het is krachtiger dan zuivering door andere methoden zoals grootte-uitsluiting of ionenwisseling chromatografie10,11. We gebruikten om te zuiveren van de IL4-10-fusieproteïne, in-house gemaakte monoklonale antistoffen tegen IL4. Evaluatie van de zuiverheid en topicale van gezuiverde IL4-10 fusieproteïne wordt uitgevoerd als onderdeel van de kwaliteitscontrole. De zuiverheid van de geproduceerde partijen wordt geëvalueerd door elektroforese natrium Dodecyl Sulfaat polyacrylamidegel (SDS-PAGE) en hoge druk-Size-Exclusion Chromatography (HP-SEC). De topicale van de IL4-10-fusieproteïne wordt geëvalueerd door het meten van haar vermogen om te remmen lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde Tumornecrosefactor-alfa (TNFα) productie in volbloed culturen, en vergelijken de combinatie van het individu cytokines.
Tot slot, om te testen van de capaciteit van IL4-10 fusion eiwitten voor de remming van chronische pijn, beschrijven we hoe de fusieproteïne kan worden getest als pijnstiller in gebruikte Muismodellen van aanhoudende inflammatoire pijn12,13,14 . Hier beschrijven we de methoden van een inflammatoire pijn-model. Het is echter belangrijk op te merken dat andere pijn modellen kan worden gebruikt (bijvoorbeeldneuropatische pijn modellen), afhankelijk van het onderzoek vragen die moeten worden beantwoord. Om te beoordelen pijn in deze modellen, is het belangrijk om allerlei gedrags waarin opgeroepen en niet-opgeroepen pijn maatregelen gebruiken. We beschreven hier, de methoden voor de beoordeling van wijzigingen in mechanisch en thermisch evoked gedrags reacties. Mechanische gevoeligheid op onschadelijke stimuli wordt beoordeeld met behulp van detest Von Frey, terwijl de thermische gevoeligheid wordt beoordeeld met behulp van de test Hargreaves. Nog belangrijker is, is niet-opgeroepen hyperalgesia/allodynia gemeten met behulp van de Dynamic gewicht Bearing test. Deze maatregelen zijn algemeen aanvaard als pijn maatregelen en opbrengst van belangrijke informatie over pijn drempels en potentiële pijn ervaren door de dieren15,16,17. Andere kan maatregelen voor de beoordeling van de niet-opgeroepen pijn (b.v., stimulans onafhankelijke), zoals de geconditioneerde plaats voorkeur test, waardevolle18. Om te beoordelen van het potentieel van de drug voor de remming van de pijn, we intrathecale toediening van de fusieproteïne, uitgevoerd als met deze wijze van toediening minder eiwit dosis nodig is om de pijn-gerelateerde gebieden bereiken en vermijden van systemische (kant-) effecten19, 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript wordt beschreven methoden voor de productie en de karakterisering van een recombinant IL4-10 fusieproteïne, en methoden voor het testen van de werkzaamheid in het remmen van inflammatoire hyperalgesia in muismodellen van aanhoudende inflammatoire pijn. De productie en de zuivering van de IL4-10-fusieproteïne wordt uitgevoerd op een kleine schaal. HEK293 cellen worden geselecteerd als een expressie systeem voor eiwitproductie omdat hierdoor posttranslationele modificaties die niet kunnen worden bereikt in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderdeel van dit werk werd gefinancierd door een Life Sciences Utrecht Universiteit verlenen
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
Riferimenti
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. . Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund’s Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
