Entwicklung von rekombinanten Proteinen zur Behandlung von chronischen Schmerzen
Summary
In diesem Papier bieten wir Informationen für die Methoden der Produktion und Qualitätskontrolle von einem rekombinanten Fusionsprotein IL4-10. Wir zeigen auch, wie Test die Wirksamkeit dieses Proteins, Schmerzen in einem Mausmodell der entzündlichen Schmerz zu lösen.
Abstract
Chronische Schmerzen sind schwer zu behandeln und neue Ansätze für die anhaltende Schmerzen zu beheben werden dringend benötigt. Anti-inflammatorische Zytokine sind viel versprechende Kandidaten für die Behandlung von schwächenden Schmerzzuständen aufgrund ihrer Kapazität, aberrante Neuro-immunen Interaktionen zu regulieren. Jedoch physiologisch arbeiten sie in einem Netzwerk von verschiedenen Zytokinen und daher ihre therapeutische Wirkung möglicherweise nicht optimal bei Verwendung als Stand-Alone-Drogen. Um diese Einschränkung zu umgehen, haben wir ein Fusionsprotein von entzündungshemmenden Zytokinen IL4 und IL10 entwickelt. Hier beschreiben wir die Methoden zur Herstellung und Qualitätskontrolle von rekombinanten Fusionsprotein IL4-10 und wir testen die Wirksamkeit des Fusionsproteins IL4-10, Schmerzen in einem Mausmodell der anhaltende entzündliche Schmerzen zu lösen.
Introduction
Chronischer Schmerzen bleibt eine der schwächenden und behandelt medizinische Probleme des 21. Jahrhunderts beeinflussen > 20 % der erwachsenen Bevölkerung1,2. Allerdings Behandlungen zur Linderung von chronischen Schmerzen sind oft wirkungslos oder müssen aufgrund der schweren Nebenwirkungen3eingestellt werden. Wichtig ist, derzeit verfügbaren Medikamente nur symptomatische Linderung, aber nicht wesentlich ändern oder chronischen Schmerzen zu heilen. Chronischer Schmerzen scheint, zwar eine neurologische Störung sein deutet Beteiligung des Immunsystems bei chronischen Schmerzen Entwicklung4,5. Darüber hinaus entstehen immun-basierte Ansätze zur Behandlung von Schmerzen. Anti-inflammatorische Zytokine hemmen z. B. Schmerzen in mehreren Modellen von chronischen Schmerzen6,7,8. Anti-inflammatorische Zytokine haben jedoch eine kurze Halbwertszeit, reduzieren ihre potentiellen schmerzhemmenden Wirkungen. Darüber hinaus arbeiten optimal Anti-inflammatorische Zytokine mit einander. Um diese Einschränkungen zu überwinden, verschmolzen wir vor kurzem die Anti-inflammatorische Zytokine Interleukin-4 (IL4) und Interleukin-10 (IL10) in einem Molekül. IL4-10 Fusionsproteins zeigt überlegene Wirksamkeit bei der Hemmung von chronischen entzündlichen und neuropathischen Schmerzen im Vergleich zu den einzelnen Zytokine-9. Hier beschreiben wir wie solche Schmelzverfahren Protein produziert wird, gereinigt, und wie wird die Qualität kontrolliert.
IL4-10 Schmelzverfahren Protein entsteht in menschlichen Zellen durch Transiente Transfektion von Zellen HEK293-F mit einer pUPE Expressionsvektor tragen die cDNA-Sequenz Fusionsproteins IL4-10-Codierung. HEK293-F Zellen werden ausgewählt, um für Post-translationale Modifikation des Proteins, etwas zuzulassen, die nicht in bakterieller Expressionssysteme auftritt. Zur Optimierung Glycan verschließen mit Sialinsäure Säure, cDNA Kodierung Beta-Galactoside-2, ist 3-Sialyl-Transferase im Vektor als eine zweite Transgen eingebunden. Fusionsproteins wird gereinigt mit Affinität Proteinreinigung der Kultur überstand, weil es mächtiger als Reinigung ist durch andere Methoden z.B. Größe-Ausschluss oder Ionenaustausch-Chromatographie-10,–11. IL4-10 Schmelzverfahren Protein zu reinigen, haben wir im Haus gemacht monoklonale Antikörper gegen IL4 verwendet. Beurteilung der Reinheit und Bioaktivität der gereinigten IL4-10 Schmelzverfahren Protein wird als Teil der Qualitätskontrolle durchgeführt. Die Reinheit des produzierten Chargen ist von Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und hohem Druck Größe Ausgrenzung Chromatographie (HP-SEC) bewertet. Die Bioaktivität des Fusionsproteins IL4-10 wird ausgewertet, indem Sie messen ihre Handlungsfähigkeit Lipopolysaccharid (LPS) hemmen-induzierten Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF) Produktion in Vollblut Kulturen, und vergleicht sie die Kombination der einzelnen Zytokine.
Schließlich, um zu testen, die Kapazität von Fusionsproteinen IL4-10, chronischen Schmerzen zu hemmen, beschreiben wir, wie die Schmelzverfahren Protein als Analgetikum in weit verbreiteten Mausmodellen entzündliche Dauerschmerzen12,13,14 getestet werden können . Hier beschreiben wir die Methoden eines entzündlichen Schmerz-Modells. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass andere Schmerzen Modelle verwendet (z. B.neuropathischen Schmerzen Modelle), abhängig von der Forschung Fragen, die beantwortet werden müssen. Um Schmerzen in diesen Modellen zu beurteilen, ist es wichtig, eine Vielzahl von Verhaltensmaßnahmen, die enthalten hervorgerufen und nicht-evozierten Schmerzen Maßnahmen verwenden. Hier beschrieben wir die Methoden der Bewertung für Änderungen in mechanisch und thermisch evozierten Verhaltensreaktionen. Mechanische Empfindlichkeit auf harmlose Reize ist anhand des Von Frey-Tests während thermische Empfindlichkeit mit dem Hargreaves Test bewertet wird. Wichtig ist, wird mit der dynamischen Gewicht tragen Test-evozierten Hyperalgesie/Allodynie gemessen. Diese Maßnahmen sind als Schmerzen Maßnahmen angenommen und liefern wichtige Hinweise zur Schmerzschwellen und mögliche Schmerzen bei Tieren15,16,17. Andere Maßnahmen zur-evozierten Schmerzen (z.B. Reiz unabhängig), z. B. die konditionierten Ort Präferenz Test beurteilen, möglicherweise wertvolle18. Um das Potenzial des Medikaments zur Hemmung von Schmerzen zu beurteilen, führten wir intrathekale Verabreichung des Fusionsproteins, wie mit dieser Art der Verabreichung weniger Protein-Dosis erforderlich ist, um Schmerzen zusammenhängende Bereiche zu erreichen und zu vermeiden systemische (Seiten-) Effekte19, 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript beschreibt Methoden für die Herstellung und Charakterisierung von einem rekombinanten Fusionsprotein IL4-10 und Methoden, um seine Wirksamkeit zu testen, bei der Hemmung von entzündlichen Hyperalgesie in Mausmodellen der entzündlichen Dauerschmerzen. Die Herstellung und Reinigung des Fusionsproteins IL4-10 wird in kleinem Maßstab durchgeführt. HEK293 Zellen werden als Ausdruck System für die Proteinproduktion ausgewählt, weil sie Post-translationalen Modifikationen ermöglichen, die in prokaryoti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teil dieser Arbeit wurde gefördert durch eine Utrecht University Life Sciences gewähren
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
Riferimenti
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