Desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica
Summary
Neste artigo nós fornecemos detalhes para os métodos de produção e controle de qualidade de uma proteína de fusão recombinante IL4-10. Também mostramos como testar a eficácia desta proteína para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória.
Abstract
Dor crônica é difícil de tratar e novas abordagens para resolver a dor persistente são urgentemente necessárias. Citocinas anti-inflamatórias são candidatos promissores para tratar condições de dor debilitante devido à sua capacidade de regular as interações de neuro-imune aberrantes. No entanto, fisiologicamente, eles trabalham em uma rede de várias citocinas, e consequentemente o seu efeito terapêutico não pode ser ideal quando usado como stand-alone drogas. Para superar esta limitação, nós desenvolvemos uma proteína de fusão das citocinas anti-inflamatórias, IL4 e IL10. Aqui, descrevemos os métodos de produção e controle de qualidade da proteína de fusão recombinante IL4-10 e testamos a eficácia da proteína de fusão do IL4-10, para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória persistente.
Introduction
Dor crônica continua sendo um dos problemas médicos mais debilitantes e sob-Tratado do século XXI, afetando > 20% da população adulta1,2. No entanto, tratamentos para proporcionar alívio da dor crônica, muitas vezes são ineficazes ou devem ser descontinuados devido a efeitos colaterais graves3. Importante, atualmente drogas disponíveis apenas fornecer alívio sintomático, mas não significativamente modificar ou curar dor crônica. Embora a dor crônica parece ser um distúrbio neurológico, a evidência sugere envolvimento do sistema imunológico em dor crônica desenvolvimento4,5. Além disso, a imune-abordagens para tratar a dor estão surgindo. Por exemplo, citocinas anti-inflamatórias inibem a dor em diversos modelos de dor crônica6,7,8. No entanto, citocinas anti-inflamatórias tem uma meia-vida curta, reduzindo seus potenciais efeitos de inibição de dor. Além disso, a citocinas anti-inflamatórias mais otimamente trabalham em conjunto com o outro. Para superar essas limitações, nós recentemente fundiu as citocinas anti-inflamatórias interleucina-4 (IL4) e interleucina-10 (IL10) em uma molécula. A proteína de fusão de IL4-10 mostra eficácia superior na inibição crônica dor inflamatória e neuropática, comparado com o de citocinas individuais9. Aqui descrevemos como tal proteína da fusão é produzida, purificado, e como sua qualidade é controlada.
Proteína de fusão de IL4-10 é produzida em células humanas por transfecção transiente de células HEK293-F com um vetor de expressão pUPE carregando a sequência de cDNA codificação da proteína de fusão de IL4-10. Células HEK293-F são escolhidas para permitir a modificação borne-translational da proteína, algo que não ocorre em sistemas de expressão bacteriana. Para otimizar glicano tampando com ácido siálico, cDNA codificação beta-galactoside-2, 3-sialyl-transferase é incorporada no vetor como um segundo transgene. A proteína de fusão purified usando a purificação da proteína de afinidade do sobrenadante da cultura porque é mais poderoso do que a purificação por cromatografia de troca iônica10,11ou outros métodos , por exemplo, tamanho-exclusão. Para purificar a proteína de fusão de IL4-10, usamos in-house feitas os anticorpos monoclonais contra IL4. Avaliação da pureza e bioatividade de purificado da proteína de fusão de IL4-10 são realizadas como parte do controle de qualidade. A pureza dos lotes produzidos é avaliada por sódio Dodecil sulfato de eletroforese em Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e alta pressão cromatografia de exclusão (HP-SEC). A bioatividade da proteína de fusão do IL4-10 é avaliada pela sua capacidade de inibir o lipopolissacarídeo (LPS) de medição-induzido por produção de fator de necrose tumoral-alfa (TNFa) em culturas de sangue total e comparando com a combinação do indivíduo citocinas.
Finalmente, para testar a capacidade das proteínas de fusão IL4-10 para inibir a dor crônica, descrevemos como a proteína de fusão pode ser testada como analgésico em modelos do rato amplamente utilizado de dor inflamatória persistente12,13,14 . Aqui descrevemos os métodos de um modelo de dor inflamatória. No entanto, é importante notar que outros modelos de dor pode ser usado (por exemplo, modelos de dor neuropática), dependendo da pesquisa perguntas que precisam ser respondidas. Para avaliar a dor nesses modelos, é importante o uso de uma variedade de medidas comportamentais que incluem evocadas e não evocava dor. Aqui, descrevemos os métodos de avaliação de mudanças na mecânica e termicamente evocadas respostas comportamentais. Sensibilidade mecânica a estímulos inócuos é avaliada através do teste de Von Frey, enquanto a sensibilidade térmica é avaliada utilizando o teste de Hargreaves. Importante, hiperalgesia/alodinia evocada não é medida através do teste de rolamento de peso dinâmico. Estas medidas são amplamente aceitos como medidas de dor e produzem informações importantes sobre os limiares de dor e potencial dor experimentada pelos animais15,16,17. Outras medidas para avaliar a dor não evocados (por exemplo, independentes de estímulo), tais como o teste de preferência de lugar condicionado, pode ser valioso18. Para avaliar o potencial da droga para inibir a dor, realizamos a administração intratecal da proteína de fusão, como com esta via de administração menos dose de proteína é necessário para alcançar áreas relacionados à dor e evitar sistêmica (lado) efeitos19, 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito descreve métodos para a produção e caracterização de um recombinante da proteína de fusão de IL4-10 e métodos para testar a sua eficácia na inibição de hiperalgesia inflamatória em modelos do rato da dor inflamatória persistente. A produção e purificação da proteína de fusão do IL4-10 é realizada em pequena escala. Células HEK293 são Selecionadodas como um sistema de expressão para produção de proteína, porque eles permitem modificações borne-translational que não podem ser re…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parte deste trabalho foi financiado por uma Universidade Utrecht Life Sciences conceder
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
Riferimenti
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