Utveckling av rekombinanta proteiner att behandla kronisk smärta
Summary
I detta papper tillhandahåller vi Detaljer för metoder för produktion och kvalitetskontroll av en IL4-10 rekombinant fusionsprotein. Vi visar också hur att testa effektiviteten av detta protein att lösa smärta i en musmodell för inflammatorisk smärta.
Abstract
Kronisk smärta är svårbehandlad och nya metoder att lösa ihållande smärta behövs omgående. Anti-inflammatoriska cytokiner är lovande kandidater för behandling av försvagande smärta villkor på grund av deras förmåga att reglera avvikande neuro-immun interaktioner. Men de arbetar fysiologiskt i ett nätverk av olika cytokiner och deras terapeutiska effekt kan därför inte vara optimalt när de används som fristående droger. För att övervinna denna begränsning, utvecklade vi ett fusionsprotein av den antiinflammatoriska cytokiner IL4 och IL10. Här beskriver vi metoderna för produktion och kvalitetskontroll av IL4-10 rekombinant fusionsprotein och vi testa effektiviteten av IL4-10 fusion proteinet att lösa smärta i en musmodell av ihållande inflammatorisk smärta.
Introduction
Kronisk smärta är fortfarande en av de mest försvagande och underbehandlad medicinska problem av 2000-talet som påverkar > 20% av den vuxna befolkning1,2. Dock är ofta ineffektiva behandlingar för att ge lindring av kronisk smärta eller måste avbrytas på grund av allvarliga biverkningar3. Ännu viktigare, för närvarande tillgängliga läkemedel endast ge symtomlindring, men inte avsevärt ändra eller bota kronisk smärta. Även kronisk smärta verkar vara en neurologisk sjukdom, tyder på engagemang av immunsystemet i kronisk smärta utveckling4,5. Dessutom framträder immun-baserade metoder för att behandla smärta. Exempelvis hämmar antiinflammatoriska cytokiner smärta i flera modeller av kronisk smärta6,7,8. Antiinflammatoriska cytokiner har dock en kort halveringstid, att minska de smärthämmande effekterna. Dessutom fungerar antiinflammatoriska cytokiner mest optimalt i samförstånd med varandra. För att övervinna dessa begränsningar, smält vi nyligen den antiinflammatoriska cytokiner interleukin-4 (IL4) och interleukin-10 (IL10) i en molekyl. Proteinet IL4-10 fusion visar bättre effekt i att hämma kronisk inflammatorisk och neuropatisk smärta jämfört med de enskilda cytokiner9. Beskriver här vi hur sådana fusionsprotein produceras, renat, och hur dess kvalitet kontrolleras.
IL4-10 fusionsprotein produceras i mänskliga celler av övergående transfection HEK293-F celler med en pUPE uttryck vektor transporterar cDNA sekvensen kodning proteinet IL4-10 fusion. HEK293-F celler väljs för posttranslationella modifieringen av protein, något som inte förekommer i bakteriell uttryck system. För att optimera glycan tak med sialic acid, cDNA kodning beta-galactoside-2, införlivas 3-sialyl-transferas i vektorn som en andra transgenens. Fusionsprotein renas med affinitet protein rening av kulturen supernatant eftersom det är mer kraftfull än rening genom andra metoder t.ex. storlek-uteslutning eller jonbyte kromatografi10,11. För att rena IL4-10 fusion proteinet, använde vi in-house gjorde monoklonala antikroppar mot IL4. Utvärdering av renhet och bioaktivitet av renat IL4-10-fusionsprotein utförs som en del av kvalitetskontroll. Renhet av producerade partier utvärderas av Sodium Dodecyl Sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) och höga tryck storlek utslagning kromatografi (HP-SEC). Bioaktiviteten av proteinet IL4-10 fusion utvärderas genom att mäta dess förmåga att hämma lipopolysackarid (LPS)-inducerad tumörnekrosfaktor-alfa (TNFα) produktion i helblod kulturer, och jämföra den till en kombination av enskilda cytokiner.
Slutligen för att testa IL4-10 fusionsproteinerna förmåga att hämma kronisk smärta, beskriver vi hur proteinet fusion kan testas som smärtstillande i utbredda musmodeller av ihållande inflammatorisk smärta12,13,14 . Här beskriver vi metoderna för en inflammatorisk smärta modell. Det är dock viktigt att notera att andra smärta-modeller kan vara används (t.ex., neuropatisk smärta modeller), beroende på forskningen frågor som behöver besvaras. För att bedöma smärta i dessa modeller, är det viktigt att använda en mängd beteendemässiga åtgärder som inkluderar framkallat och icke-framkallat smärta åtgärder. Här, beskrivit vi metoderna för bedömning av förändringar i mekaniskt och termiskt evoked beteendemässiga svaren. Mekaniska känslighet för innocuous stimuli bedöms med Von Frey testet, medan Termisk känslighet bedöms i Hargreaves test. Allt mäts icke-framkallat hyperalgesi/allodyni med det dynamiska vikt bär-testet. Dessa åtgärder är allmänt accepterade som smärta åtgärder och ge viktig information om smärttrösklar och potentiella smärta upplevs av den djur15,16,17. Andra åtgärder för att bedöma icke-framkallat smärta (t.ex., stimulans oberoende), t ex betingad plats preferens test kan vara värdefulla18. För att bedöma potentialen av läkemedlet som hämmar smärta, utfört vi intratekal administrering av proteinet fusion, som med detta administreringssätt mindre protein dos som behövs för att nå smärta-relaterade områden och undvika systemiska (side-) effekter19, 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta manuskript beskriver metoder för tillverkning och karakterisering av ett rekombinant IL4-10 fusionsprotein, och metoder för att testa dess effektivitet i att hämma inflammatoriska hyperalgesi i musmodeller av ihållande inflammatorisk smärta. Produktion och rening av proteinet IL4-10 fusion utförs i liten skala. HEK293 celler är markerade som ett uttryck system för produktion av proteiner eftersom de möjliggör post-translationella modifieringar som inte kan uppnås i prokaryota uttryck system. Post-transla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Del av arbetet har finansierats av en Utrecht University Life Sciences bevilja
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
Riferimenti
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. . Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund’s Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
