स्तनधारी कोशिकाओं को प्रोटियोमिक् के लिए क्रोमेटिन-जुड़े प्रोटीन का संकरण कैप्चर का अनुकूलन
Summary
यह एक विधि उपंयास डीएनए की पहचान करने के लिए विशिष्ट लक्ष्य loci पर प्रोटीन बातचीत, बाद proteomic विश्लेषण के लिए crosslinked क्रोमेटिन के अनुक्रम विशेष कब्जा पर निर्भर है । संभावित बाध्यकारी प्रोटीन के बारे में कोई पूर्व ज्ञान, और न ही सेल संशोधनों की आवश्यकता है । शुरू में खमीर के लिए विकसित की है, प्रौद्योगिकी अब स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है ।
Abstract
प्रोटियोमिक् (HyCCAPP) प्रौद्योगिकी के लिए क्रोमेटिन-जुड़े प्रोटीन का संकरण कैप्चर शुरू में खमीर में उपंयास डीएनए प्रोटीन बातचीत को उजागर करने के लिए विकसित किया गया था । यह ब्याज की संभावना के बारे में पूर्व ज्ञान की आवश्यकता के बिना एक लक्ष्य क्षेत्र के विश्लेषण की अनुमति देता है लक्ष्य क्षेत्र के लिए बाध्य प्रोटीन के बारे में । यह, सिद्धांत रूप में, HyCCAPP के हित के किसी भी जीनोमिक क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है, और यह अलग सेल सिस्टम में काम करने के लिए पर्याप्त लचीलापन प्रदान करता है । इस विधि के लिए जाना जाता प्रतिलेखन कारकों, एक बेहतर क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप) और चिप की तरह तरीकों के लिए अनुकूल कार्य के बंधन साइटों का अध्ययन करने का मतलब नहीं है । HyCCAPP की ताकत के लिए डीएनए क्षेत्रों के लिए जो वहां सीमित है या इसे करने के लिए बाध्य प्रोटीन के बारे में कोई जानकारी का पता लगाने की क्षमता में निहित है । यह भी पूर्वाग्रह से बचने के लिए एक सुविधाजनक तरीका हो सकता है (चिप की तरह वर्तमान तरीकों में मौजूद) एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रोटीन आधारित क्रोमेटिन संवर्धन द्वारा शुरू की । संभावित, HyCCAPP वास्तव में उपंयास डीएनए-प्रोटीन बातचीत को उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है । तारीख करने के लिए, प्रौद्योगिकी मुख्य रूप से खमीर कोशिकाओं को लागू किया गया है या उच्च प्रतिलिपि दोहराने के स्तनधारी कोशिकाओं में अनुक्रम । आदेश में हम कल्पना शक्तिशाली उपकरण बनने के लिए, HyCCAPP दृष्टिकोण को कुशलतापूर्वक स्तनधारी कोशिकाओं में एकल प्रतिलिपि loci पर कब्जा करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है । यहां, हम मानव कोशिका लाइनों के लिए प्रारंभिक खमीर HyCCAPP कैप्चर प्रोटोकॉल के हमारे अनुकूलन मौजूद है, और पता चलता है कि एक प्रतिलिपि क्रोमेटिन क्षेत्रों कुशलता से इस संशोधित प्रोटोकॉल के साथ अलग किया जा सकता है ।
Introduction
पिछले एक दशक के दौरान, वहां अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में एक नाटकीय सुधार देखा है, नमूनों की बड़ी संख्या में जीनोम की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन की अनुमति है, और आश्चर्यजनक संकल्प के साथ । डीएनए तत्वों (सांकेतिक शब्दों में बदलना) कंसोर्टियम, एक बड़े पैमाने पर बहु-संस्थागत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय मानव जीनोम रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा नेतृत्व के प्रयास के विश्वकोश, कैसे व्यक्तिगत प्रतिलेखन कारकों में अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है और अंय नियामक प्रोटीन के लिए बांध और जीनोम के साथ बातचीत । प्रारंभिक प्रयास विशिष्ट डीएनए प्रोटीन बातचीत विशेषता, के रूप में १०० से अधिक ज्ञात डीएनए के लिए क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) द्वारा मूल्यांकन-बंधन प्रोटीन1। ऐसे DNase के पदचिह्न के रूप में वैकल्पिक तरीकों2 और विनियामक तत्वों के formaldehyde असिस्टेड अलगाव (साफ)3 भी प्रोटीन के साथ बातचीत जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन स्पष्ट सीमा के साथ कि इन प्रायोगिक दृष्टिकोण से बातचीत प्रोटीन की पहचान नहीं है । पिछले वर्षों में व्यापक प्रयासों के बावजूद, कोई प्रौद्योगिकी उभरा है कि कुशलतापूर्वक क्रोमेटिन में प्रोटीन-डीएनए बातचीत के व्यापक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, और पहचान और क्रोमेटिन के ठहराव-जुड़े प्रोटीन ।
इस जरूरत को हल करने के लिए, हम एक उपंयास दृष्टिकोण है जो हम प्रोटियोमिक् (HyCCAPP) के लिए क्रोमेटिन-जुड़े प्रोटीन के संकरण कब्जा के रूप में कहा विकसित की है । शुरू में खमीर4,5,6में विकसित की है, दृष्टिकोण crosslinked क्रोमेटिन ब्याज की (बाध्य प्रोटीन के साथ) क्षेत्रों अनुक्रम विशिष्ट संकरण कब्जा का उपयोग अलग । प्रोटीन-डीएनए परिसरों के अलगाव के बाद, ऐसे जन स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में दृष्टिकोण के लिए ब्याज के अनुक्रम के लिए बाध्य प्रोटीन के सेट की विशेषता इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रकार, HyCCAPP एक गैर पक्षपातपूर्ण दृष्टिकोण के रूप में विचार किया जा सकता है उपंयास डीएनए को उजागर-प्रोटीन बातचीत, अर्थ है कि यह एंटीबॉडी पर भरोसा नहीं करता है और यह प्रोटीन है कि पाया जा सकता है के बारे में पूरी तरह से नास्तिक है । वहां अंय उपंयास डीएनए-बातचीत प्रोटीन7उजागर करने में सक्षम दृष्टिकोण हैं, लेकिन सबसे चिप की तरह तरीकों पर भरोसा करते है8,9,10, प्लाज्मिड निवेशन11,12, 13,14, या उच्च प्रतिलिपि संख्या15के साथ क्षेत्रों । इसके विपरीत, HyCCAPP बहु और एकल प्रतिलिपि क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है, और यह क्षेत्र में प्रोटीन के बारे में कोई पूर्व जानकारी की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, जबकि उपर्युक्त विधियों में से कुछ मूल्यवान विशेषताएं हैं, विशेष रूप से डीएनए के लिए की आवश्यकता से परहेज-प्रोटीन crosslinking प्रतिक्रियाओं, HyCCAPP की अनूठी विशेषता यह है कि यह एकल के लिए लागू किया जा सकता है, unभएकै कोशिकाओं में प्रतिलिपि क्षेत्रों, और बिना किसी भी ख्यात बंधन प्रोटीन, या उपलब्ध एंटीबॉडी के बारे में पहले ज्ञान ।
इस बिंदु पर, HyCCAPP मुख्य रूप से खमीर में विभिंन जीनोमिक क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए लागू किया गया है4,5,6, और हाल ही में प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अल्फा में डीएनए बातचीत-सैटेलाइट डीएनए, एक दोहराने क्षेत्र मानव जीनोम16में । हमारे चल रहे काम के भाग के रूप में, हम संकरण कब्जा दृष्टिकोण शुरू में खमीर क्रोमेटिन के लिए विकसित करने के लिए मानव कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए लागू अनुकूलित है, और यहां वर्तमान एक संशोधित प्रोटोकॉल है कि एकल प्रतिलिपि लक्ष्य के चयनात्मक कब्जा अनुमति देता है खमीर में हमारे प्रारंभिक अध्ययन करने के लिए इसी तरह की क्षमता के साथ मानव जीनोम में क्षेत्रों । इस नए अनुकूलित प्रोटोकॉल अब अनुकूलन और प्रौद्योगिकी के उपयोग के लिए मानव जीनोम भर में प्रोटीन डीएनए बातचीत, मास स्पेक्ट्रोमेट्री या अंय विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर की अनुमति देता है ।
यह जोर देना महत्वपूर्ण है कि HyCCAPP विधि विशिष्ट लक्षित क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए है और अभी तक जीनोम-वाइड विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है । प्रौद्योगिकी विशेष रूप से उपयोगी है जब क्षेत्रों के लिए जो वहां प्रोटीन बातचीत के बारे में दुर्लभ जानकारी है, या जब एक विशिष्ट जीनोम लोकस में एक अधिक व्यापक प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण में वांछित है से निपटने । HyCCAPP डीएनए बंधन प्रोटीन को उजागर करने के लिए मतलब है, लेकिन सही जीनोमिक डीएनए में विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की विशेषताएं नहीं । इसके वर्तमान कार्यान्वयन में पद्धति व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए डीएनए बाइंडिंग दृश्यों या रूपांकनों के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करती है । इसलिए, यह अच्छी तरह से ऐसे मेलों के रूप में मौजूदा प्रौद्योगिकियों के पूरक हैं, और जीनोमिक एक प्रारंभिक निष्पक्ष विश्लेषण द्वारा पहचान क्षेत्रों में उपंयास बंधन प्रोटीन की पहचान की अनुमति दे सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
HyCCAPP विधि यहां वर्णित कई अनूठी विशेषताएं है कि यह एक शक्तिशाली दृष्टिकोण डीएनए-बातचीत है कि अंयथा मायावी रहेगा उजागर करना है । इस प्रक्रिया की प्रकृति विभिन्न जीवों और जीनोम के क्षेत्रों में काम करने क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य का समर्थन NIH पलाश P50HG004952 व R01GM109099 के मो.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
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