Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos
Summary
Se trata de un método para identificar nuevas proteínas DNA-que obran recíprocamente en lugares geométricos específicos, basándose en la captura de la secuencia específica de cromatina reticular para análisis proteómicos posteriormente. No se requiere ningún conocimiento previo sobre posibles proteínas, ni modificaciones de la célula. Inicialmente desarrollado para la levadura, la tecnología ahora se ha adaptado para células de mamífero.
Abstract
La captura de la hibridación de las proteínas asociadas a cromatina para tecnología de la proteómica (HyCCAPP) fue inicialmente desarrollada para descubrir nuevas interacciones ADN-proteína en levaduras. Permite el análisis de una región de objetivo de interés sin necesidad de conocimientos previos sobre las proteínas probablemente vinculado a la región de destino. Esto, en teoría, permite HyCCAPP a utilizarse para analizar cualquier región genómica de interés, y proporciona suficiente flexibilidad para trabajar en sistemas de células diferentes. Este método no es para el estudio de sitios de Unión conocido de factores de transcripción, una tarea más adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y viruta-como métodos. La fuerza de HyCCAPP reside en su capacidad de explorar regiones de ADN que es limitado o ningún conocimiento sobre las proteínas limitado a él. También puede ser un método conveniente para evitar sesgos (presente en la viruta-como métodos) introducidos por el enriquecimiento de la base de proteínas de la cromatina mediante anticuerpos. Potencialmente, HyCCAPP puede ser una poderosa herramienta para descubrir interacciones DNA proteína verdaderamente novedosas. Hasta la fecha, la tecnología ha sido aplicada principalmente a las células de levadura o a secuencias de la repetición copia alta en células de mamíferos. Para convertirse en la herramienta que tenemos la visión, enfoques HyCCAPP deban ser optimizada para capturar eficientemente loci de la solo-copia en células de mamíferos. Presentamos la adaptación de la levadura inicial HyCCAPP captura de protocolo a líneas celulares humanas y muestran que las regiones de la cromatina de la solo-copia pueden ser eficientemente aisladas con este protocolo modificado.
Introduction
Durante la última década, ha visto una mejora dramática en tecnologías de secuenciación, permitiendo el estudio de una amplia gama de los genomas en gran número de muestras y con una resolución asombrosa. El consorcio de la enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE), un esfuerzo multi-institucional a gran escala dirigido por el nacional Instituto de investigación de genoma humano de los institutos nacionales de salud, ha proporcionado ideas sobre cómo los factores de transcripción y se unen a otras proteínas reguladoras e interactúan con el genoma. El esfuerzo inicial caracteriza interacciones DNA proteína, según lo determinado por la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para más de 100 conocidos de proteínas DNA-que atan1. Métodos alternativos como el DNase footprinting2 formaldehído asistida aislamiento de elementos reguladores (FAIRE)3 también han sido utilizados para localizar regiones específicas del genoma interactuando con proteínas, pero con la limitación obvia de que Estas aproximaciones experimentales no identifican las proteínas obran recíprocamente. A pesar de los grandes esfuerzos en los últimos años, no ha emergido ninguna tecnología que permite eficazmente la caracterización completa de las interacciones proteína-ADN en cromatina y la identificación y cuantificación de proteínas asociadas a cromatina.
Para abordar esta necesidad, hemos desarrollado un nuevo enfoque que hemos denominadas como Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteínas de Proteómica (HyCCAPP). Desarrollado inicialmente en levadura4,5,6, lo aísla reticulado cromatina las regiones de interés (con proteínas dependientes) mediante captura hibridación específica de secuencia. Después de aislamiento de los complejos de proteína ADN, métodos como la espectrometría de masas pueden utilizarse para caracterizar el conjunto de proteínas a la secuencia de interés. Así, HyCCAPP puede considerarse como un enfoque imparcial para descubrir la novela interacciones DNA proteína, en el sentido de que no se basa en anticuerpos y es totalmente agnóstico sobre las proteínas que se pueden encontrar. Hay otros enfoques capaces de descubrir la novela interacción con DNA proteínas7, pero dependen más de viruta-como métodos8,9,10, plásmido inserciones11,12, 13,14, o regiones con alta copia número15. En cambio, HyCCAPP puede ser aplicado a las regiones múltiples y solo copia y no requiere ninguna información previa acerca de las proteínas en la región. Además, mientras que algunos de los métodos mencionados arriba han características valiosas, en particular evitando la necesidad para reacciones de entrecruzamiento de ADN-proteína, la característica única de HyCCAPP es que puede aplicarse a regiones solo copia sin modificar las células y sin ninguna conocimiento previo acerca de supuestas proteínas o anticuerpos disponibles.
En este punto, predominante se ha aplicado al análisis de varias regiones genómicas en levadura4,5,6HyCCAPP y recientemente se utilizó para analizar las interacciones proteína-ADN en ADN satélite alfa, una región de repetición en el genoma humano16. Como parte de nuestra labor, hemos adaptado el enfoque de captura hibridación inicialmente desarrollado para que la cromatina de la levadura ser aplicable al análisis de las células humanas y aquí presentamos un protocolo modificado que permite la captura selectiva de destino de la solo-copia regiones en el genoma humano con eficiencias similares a nuestros estudios iniciales en la levadura. Este nuevo protocolo optimizado permite la adaptación y utilización de la tecnología para interrogar las interacciones proteína-DNA en el genoma humano, mediante espectrometría de masas u otros enfoques analíticos.
Es importante destacar que el método HyCCAPP está diseñado para el análisis de regiones de objetivo específico y no es conveniente para el análisis del genoma. La tecnología es especialmente útil cuando se trata de regiones para las cuales hay escasa información sobre las proteínas obran recíprocamente, o cuando se desea un análisis profundo más amplio de proteínas obran recíprocamente en un locus específico del genoma. HyCCAPP pretende descubrir proteínas DNA-que atan pero no caracterizar con precisión los sitios de unión de proteínas específicas en la DNA genomic. En su implementación actual, la metodología no proporciona información sobre las secuencias de DNA que atan o motivos para proteínas individuales. Por lo tanto, muy bien complementa las tecnologías existentes como la feria y puede permitir la identificación de nuevas proteínas en regiones genómicas identificado por un análisis inicial de la feria.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de HyCCAPP descrito aquí tiene muchas características únicas que lo convierten en un enfoque de gran alcance para descubrir el ADN-las interacciones que de lo contrario seguiría siendo difícil de alcanzar. La naturaleza del proceso da HyCCAPP la flexibilidad para trabajar en diferentes organismos y regiones del genoma. Es un método, sin embargo, que tiene varias limitaciones a tener en cuenta.
HyCCAPP es un método que evita las modificaciones celulares que potencialmente pued…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH P50HG004952 y R01GM109099 a MO.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
Riferimenti
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