Tilpasning av hybridisering erobringen av Chromatin-assosiert proteiner for Proteomikk til pattedyrceller
Summary
Dette er en metode for å identifisere romanen DNA-samspill proteiner på bestemt mål loci, stole på sekvens-spesifikke erobringen av krysskoblet chromatin for påfølgende proteomic analyser. Det kreves ingen forhåndskunnskaper om potensielle bindende proteiner, eller cellen modifikasjoner. Opprinnelig utviklet for gjær, har teknologien nå blitt tilpasset for pattedyrceller.
Abstract
Hybridisering erobringen av chromatin-assosiert proteiner for Proteomikk (HyCCAPP) teknologien ble opprinnelig utviklet for å avdekke romanen DNA-protein interaksjoner i gjær. Den lar analyse av et mål område rundt uten forutgående kunnskap om sannsynlig proteiner bundet målregion. Dette, i teorien, kan HyCCAPP brukes til å analysere alle genomic område av interesse, og det gir tilstrekkelig fleksibilitet til å arbeide i ulike celle systemer. Denne metoden er ikke ment å studere bindende områder av kjente transkripsjonsfaktorer, en oppgave bedre egnet for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) og ChIP-lignende metoder. HyCCAPP styrke ligger i dens evne til å utforske DNA regioner som det er begrenset eller ingen kunnskap om proteiner knyttet til seg. Det kan også være en praktisk metode for å unngå skjevheter (finnes i ChIP-lignende metoder) introdusert av protein-basert chromatin berikelse bruker antistoffer. Muligens kan HyCCAPP være et kraftig verktøy for å avdekke virkelig romanen DNA-protein interaksjoner. Hittil er teknologien hovedsakelig brukt til gjærceller eller høy kopi gjenta sekvenser i pattedyrceller. For å bli den kraftige verktøyet vi ser, må HyCCAPP tilnærminger være optimalisert for å effektivt ta enkelt-kopi loci i pattedyrceller. Her presenterer vi tilpasningen av første gjær HyCCAPP fange protokollen humane cellelinjer, og viser at enkelt-kopi chromatin regioner kan være effektivt isolert med denne endret protokollen.
Introduction
I løpet av siste tiår har det sett en dramatisk forbedring i sekvensering teknologi, slik at studiet av en rekke genomer i stort antall av prøvene, og med forbløffende oppløsning. Encyclopedia av DNA elementer (kode) konsortiet, omfattende multi institusjonelle innsats spissen av National Human Genome Research Institute av National Institutes of Health, har gitt innsikt i hvordan enkelte transkripsjonsfaktorer og andre regulerende proteiner bindes til og samhandle med genomet. Den første innsatsen preget spesifikke DNA-protein interaksjoner, som vurdert av Chromatin immunoprecipitation (ChIP) for over 100 kjent DNA-bindende proteiner1. Alternative metoder som DNase footprinting2 og formaldehyd assistert isolering av regulatoriske elementer (FAIRE)3 har også blitt brukt til å finne bestemte regioner i genomet samspill med proteiner, men med tydelig begrensning som disse eksperimentelle tilnærminger finner ikke samspill proteiner. Til tross for omfattende innsats de siste årene, har ingen teknologi framstått som effektivt lar omfattende karakterisering av protein-DNA interaksjoner i chromatin, og identifikasjon og måling av chromatin-assosiert proteiner.
For å møte utviklet vi en ny tilnærming som vi betegnes som Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteiner for Proteomikk (HyCCAPP). Opprinnelig utviklet i gjær4,isolerer5,6, tilnærming krysskoblet chromatin regioner av interesse (med bundet proteiner) bruker sekvens-spesifikke hybridisering capture. Etter isolering av protein-DNA komplekser, kan tilnærminger som massespektrometri brukes å karakterisere settet med proteiner bundet til rekkefølgen av interesse. HyCCAPP kan dermed betraktes som en ikke-partisk tilnærming å avdekke romanen DNA-protein interaksjoner, i den forstand at den ikke stole på antistoffer og det er helt agnostiker om proteiner som kan bli funnet. Det er andre tilnærminger i stand til å avdekke romanen DNA-samspill proteiner7, men mest stole på ChIP-lignende metoder8,9,10, plasmider innsettinger11,12, 13,14eller regioner med høy kopi nummer15. I motsetning HyCCAPP kan brukes på multi – og enkelt-kopi regioner, og det krever ikke tidligere informasjon om proteinene i regionen. I tillegg, mens noen av metodene nevnt ovenfor har verdifull funksjoner, spesielt unngå behovet for DNA-protein crosslinking reaksjoner, unike med HyCCAPP er at den kan brukes til enkelt-kopi områder i uendret celler, og uten forutgående kunnskap om antatte bindende proteiner eller tilgjengelig antistoffer.
Foreløpig HyCCAPP er hovedsakelig brukt til analyse av ulike genomisk regioner i gjær4,5,6, og nylig ble brukt til å analysere protein-DNA interaksjoner i alpha-satellitt DNA, en gjenta region i det menneskelige genom16. Som en del av vår pågående arbeid, har vi tilpasset hybridisering fange tilnærming opprinnelig utviklet for gjær chromatin gjelder for analyse av menneskelige celler, og presenterer her en endret protokoll som tillater selektiv erobringen av enkelt-kopi mål regionene i det menneskelige genomet med effektivitet ligner på våre første studier i gjær. Denne nye optimalisert protokollen tillater nå tilpasning og utnyttelse av teknologi for å avhøre protein-DNA interaksjoner over det menneskelige genomet, massespektrometri eller andre analytiske metoder.
Det er viktig å understreke at metoden HyCCAPP er ment for analyse av bestemt målrettingsregioner og ennå ikke er egnet for genomet hele analyser. Teknologien er spesielt nyttig når du arbeider med områder som det er lite informasjon om samspill proteiner, eller når en mer omfattende dyptgående analyse av samspill proteiner på et bestemt genomet locus er ønsket. HyCCAPP er ment å avdekke DNA-bindende proteiner men ikke beskrive nøyaktig bestemt protein bindende områder i genomisk DNA. I gjennomføringen gjeldende gir metodikken ikke informasjon om DNA bindende sekvenser eller motiver for individuelle proteiner. Derfor det pent utfyller eksisterende teknologier som FAIRE, og kan identifikasjon av romanen bindende proteiner i genomisk områder identifisert av en innledende FAIRE analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
HyCCAPP metoden beskrevet her har mange unike funksjoner som gjør det en effektiv tilnærming til å avdekke DNA-interaksjoner som ellers ville være unnvikende. Innholdet i prosessen gir HyCCAPP fleksibilitet til å arbeide i ulike organismer og regioner i genomet. Det er en metode, men som har flere begrensninger vurderes.
HyCCAPP er en metode som unngår celle endringer slik at det kan potensielt brukes i primære cellene, cellen kultur systemer eller selv vevsprøver. Derfor imidlertid kr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd P50HG004952 og R01GM109099 til Mo
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
Riferimenti
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
- Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
- Lambert, J. -. P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
- Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
- Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
- Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
- Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
- Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).
