Tilpasning af hybridisering fange af kromatin-associerede proteiner for Proteomics til pattedyrceller
Summary
Dette er en metode til at identificere nye DNA-interagere proteiner på specifikke mål loci, afhængige af sekvens-specifikke erobringen af crosslinked kromatin for efterfølgende proteom analyser. Ingen forudgående viden om potentielle-bindende proteiner, og heller ikke celle ændringer er nødvendige. Oprindeligt udviklet til gær, er teknologien nu blevet tilpasset for pattedyrsceller.
Abstract
Hybridisering erobringen af kromatin-associerede proteiner for proteomics (HyCCAPP) teknologi blev oprindeligt udviklet for at afdække nye DNA-protein interaktioner i gær. Det giver mulighed for analyse af et målområde af interesse uden behov for forudgående viden om sandsynlige proteiner bundet til regionen mål. Dette, i teorien, mulighed for HyCCAPP skal bruges til at analysere nogen genomisk region af interesse, og det giver tilstrækkelig fleksibilitet til at arbejde i forskellige celle systemer. Denne metode er ikke beregnet til at studere bindingssteder af kendte transkriptionsfaktorer, en opgave, der er bedre egnet til kromatin Immunoprecipitation (ChIP) og ChIP-lignende metoder. HyCCAPP styrke ligger i dens evne til at udforske DNA regioner hvor der er begrænset eller ingen viden om de proteiner, der er bundet til det. Det kan også være en praktisk metode til at undgå bias (til stede i ChIP-lignende metoder) indført af protein-baserede kromatin berigelse ved hjælp af antistoffer. Potentielt, kan HyCCAPP være et effektivt redskab til at afdække virkelig roman DNA-protein interaktioner. Til dato, har teknologien blevet overvejende anvendes til gærceller eller høj kopi gentagne sekvenser i pattedyrsceller. For at blive den kraftfulde værktøj vi forestiller, skal HyCCAPP tilgange være optimeret til effektivt fange enkelt-kopi loci i pattedyrsceller. Her præsenterer vi vores tilpasning af den oprindelige gær HyCCAPP capture protokol til menneskelige cellelinjer, og vise at enkelt-kopi kromatin regioner kan isoleres effektivt med denne ændrede protokol.
Introduction
I det sidste tiår, har set en dramatisk forbedring i sekventering teknologier, giver mulighed for undersøgelse af en bred vifte af genomer i stort tal af prøver og med forbløffende opløsning. Encyklopædi af DNA elementer (INDKODE) konsortium, en omfattende multi institutionelle indsats med National Human Genome Research Institute af National Institutes of Health, i spidsen har givet indsigt i hvordan de enkelte transkriptionsfaktorer og andre regulerende proteiner binder til og interagere med genomet. Den indledende indsats karakteriseret specifikke DNA-protein interaktioner, som vurderet af kromatin immunoprecipitation (ChIP) for mere end 100 kendte DNA-bindende proteiner1. Alternative metoder såsom DNase footprinting2 og formaldehyd assisteret isolation af regulerende elementer (FAIRE)3 er også blevet brugt til at finde specifikke regioner i genomet interagere med proteiner, men med den indlysende begrænsning, disse eksperimentelle metoder kan ikke identificere de interagerende proteiner. Trods de omfattende bestræbelser i de seneste år, er der opstået ingen teknologi, der effektivt giver mulighed for omfattende karakterisering af protein-DNA interaktioner i kromatin, og identifikation og kvantificering af kromatin-associerede proteiner.
For at imødegå dette behov, udviklet vi en ny metode, som vi betegnes som Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteiner for Proteomics (HyCCAPP). I første omgang udviklet i gær4,isolerer5,6, fremgangsmåde crosslinked kromatin regioner af interesse (med bundne proteiner) ved hjælp af sekvens-specifikke hybridisering capture. Efter isolering af protein-DNA komplekser, kan tilgange såsom massespektrometri bruges til at karakterisere sæt af proteiner er bundet til sekvensen af interesse. HyCCAPP kan således betragtes som en ikke-partisk tilgang til at afdække nye DNA-protein interaktioner, i den forstand, at det ikke stole på antistoffer, og det er fuldstændig agnostisk om de proteiner, der kan findes. Der er andre tilgange i stand til at afdække roman DNA-interagere proteiner7, men mest afhængige af ChIP-lignende metoder8,9,10, plasmid indsætninger11,12, 13,14, eller områder med høj kopi numre15. Derimod HyCCAPP kan anvendes til multi – og single-kopi regioner, og det kræver ikke nogen forudgående oplysninger om proteiner i regionen. I tilføjelse, mens nogle af metoderne, der er nævnt ovenfor har værdifulde funktioner, især undgå behovet for DNA-protein crosslinking reaktioner, den enestående indslag i HyCCAPP er, at det kan anvendes til enkelt-kopi regioner i umodificerede celler og uden nogen forudgående viden om formodede bindende proteiner eller tilgængelige antistoffer.
På dette tidspunkt HyCCAPP er overvejende blevet anvendt til analysen af forskellige genomisk regioner i gær4,5,6, og for nylig blev brugt til at analysere protein-DNA interaktioner i alpha-satellit DNA, en Gentag region i det menneskelige genom16. Som en del af vores igangværende arbejde, har vi tilpasset hybridisering capture tilgang i første omgang udviklet til gær kromatin gælder for analysen af humane celler, og præsenterer her en modificeret protokol, der giver mulighed for selektiv fangst af enkelt-kopi mål regioner i det menneskelige genom med effektivitet svarer til vores indledende undersøgelser i gær. Denne nye optimeret protokol giver nu mulighed for tilpasning og udnyttelse af teknologi til at afhøre protein-DNA interaktioner på tværs af det menneskelige genom, ved hjælp af massespektrometri eller andre analytiske tilgange.
Det er vigtigt at understrege, at HyCCAPP metoden er beregnet til analyse af specifikke målområder og er endnu ikke egnet til genome-wide analyser. Teknologien er især nyttig, når der beskæftiger sig med områder, som der er sparsomme oplysninger om interagerende proteiner, eller når en mere omfattende dybdegående analyse af interagerende proteiner på en bestemt genom locus ønskes. HyCCAPP er beregnet til at afdække DNA-bindende proteiner men ikke karakterisere præcist bestemt protein bindingssteder i genomisk DNA. I sin nuværende gennemførelse indeholder metoden ikke oplysninger om DNA bindende sekvenser eller motiver for individuelle proteiner. Derfor, det pænt supplerer eksisterende teknologier såsom FAIRE, og kan give mulighed for identifikation af nye bindende proteiner i genomisk regioner identificeret ved første FAIRE analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den HyCCAPP metode beskrevet her har mange unikke funktioner, der gør det en kraftfuld tilgang til at afdække DNA-vekselvirkninger, der ellers ville forblive undvigende. Arten af processen giver HyCCAPP fleksibilitet til at arbejde i forskellige organismer og regioner i genomet. Det er en metode, der har imidlertid adskillige begrænsninger skal overvejes.
HyCCAPP er en metode, der undgår enhver celle ændringer, således at det kan potentielt kunne anvendes i primærelementer, celle kultur…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud P50HG004952 og R01GM109099 at MO.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
Riferimenti
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
- Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
- Lambert, J. -. P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
- Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
- Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
- Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
- Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
- Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).
