Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero
Summary
Si tratta di un metodo per identificare nuove proteine che interagiscono con DNA loci target specifico, basandosi sull’acquisizione di sequenza-specifico della cromatina reticolato per analisi proteomica successive. Alcuna conoscenza pregressa potenziali proteine leganti, né modifiche di cella non sono necessari. Inizialmente sviluppato per il lievito, la tecnologia ora è stata adattata per cellule di mammifero.
Abstract
La cattura di ibridazione delle proteine della cromatina associate per tecnologia proteomica (HyCCAPP) è stato inizialmente sviluppata per scoprire nuove interazioni della DNA-proteina in lievito. Consente di analizzare una regione di destinazione di interesse senza la necessità di conoscenza pregressa probabile proteine legate alla regione di destinazione. Questo, in teoria, consente di HyCCAPP essere utilizzati per analizzare qualsiasi regione genomica di interesse e fornisce una flessibilità sufficiente per lavorare in diversi sistemi cellulari. Questo metodo non è destinato a siti di legame di fattori di trascrizione noti, un compito più adatto per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e ChIP-come metodi di studio. La forza di HyCCAPP sta nella sua capacità di esplorare le regioni di DNA, per cui c’è limitata o nessuna conoscenza circa le proteine legate ad esso. Può anche essere un metodo conveniente per evitare biases (presente nel ChIP-come metodi) introdotto da arricchimento di base di proteine della cromatina usando gli anticorpi. Potenzialmente, HyCCAPP può essere un potente strumento per scoprire veramente nuove interazioni della DNA-proteina. Ad oggi, la tecnologia è stata applicata principalmente di cellule di lievito o di ripetere sequenze di alta copia in cellule di mammifero. Al fine di diventare il potente strumento che noi immaginiamo, HyCCAPP approcci devono essere ottimizzate per catturare in modo efficiente copia singola loci in cellule di mammifero. Qui, presentiamo il nostro adattamento del lievito iniziale HyCCAPP protocollo di linee cellulari umane di catturare e mostrare che regioni singola copia della cromatina possono essere efficacemente isolate con questo protocollo modificato.
Introduction
Durante la decade passata, ha visto un forte progresso nelle tecnologie di sequenziamento, permettendo lo studio di una vasta gamma dei genomi in gran numero di campioni e con sorprendente risoluzione. Il Consorzio di Enciclopedia di DNA Elements (ENCODE), uno sforzo su larga scala di multi-istituzionale guidato dal National Human Genome Research Institute, del National Institutes of Health, ha fornito le comprensioni nei fattori di trascrizione come singoli e altre proteine regolatorie associare a e interagiscono con il genoma. Lo sforzo iniziale caratterizzato interazioni DNA-proteine specifiche, come valutato da immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per oltre 100 noti DNA-binding proteins1. Metodi alternativi come dnasi footprinting2 e formaldeide assistita isolamento di elementi regolatori (FAIRE)3 sono stati utilizzati anche per individuare specifiche regioni del genoma che interagiscono con le proteine, ma con la limitazione evidente che questi approcci sperimentali non identificano le proteine interagenti. Nonostante i notevoli sforzi negli ultimi anni, nessuna tecnologia è emerso che in modo efficiente permette la completa caratterizzazione delle interazioni proteina-DNA nella cromatina e l’identificazione e la quantificazione delle proteine della cromatina-associate.
Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato un nuovo approccio che abbiamo definiti come Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteine per proteomica (HyCCAPP). Inizialmente sviluppato in lievito4,5,6, l’approccio isola reticolato della cromatina le regioni di interesse (con proteine rilegate) mediante acquisizione di ibridazione di sequenza-specifico. Dopo l’isolamento dei complessi proteina-DNA, approcci come spettrometria di massa possono essere utilizzati per caratterizzare l’insieme delle proteine associato alla sequenza di interesse. Così, HyCCAPP può essere considerato come un approccio imparziale per scoprire romanzo interazioni della DNA-proteina, nel senso che esso non si basa su anticorpi e si è completamente agnostico circa le proteine che potrebbero essere presenti. Ci sono altri approcci in grado di scoprire romanzo d’interazione DNA proteine7, ma più si basano su metodi ChIP8,9,10, plasmide inserimenti11,12, 13,14, o regioni con alta copia numeri15. Al contrario, HyCCAPP può essere applicato alle regioni multi – e unico-copia, e non richiede alcuna informazione preventiva circa le proteine nella regione. In aggiunta, mentre alcuni dei metodi menzionati sopra è di pregio, in particolare evitando la necessità per reazioni di reticolazione della DNA-proteina, la caratteristica unica di HyCCAPP è che può essere applicato alle regioni di singola copia in non modificato cellule e senza alcuna conoscenza pregressa proteine leganti presunti, o anticorpi disponibili.
A questo punto, HyCCAPP principalmente è stato applicato all’analisi delle varie regioni genomiche in lievito4,5,6e recentemente è stato utilizzato per analizzare le interazioni proteina-DNA nel DNA di alfa-satellite, una regione di ripetizione nel genoma umano16. Come parte del nostro lavoro in corso, abbiamo adattato l’approccio di cattura di ibridazione inizialmente sviluppato per cromatina lievito essere applicabile per l’analisi delle cellule umane e qui presenti un protocollo modificato che permette la cattura selettiva di copia singola destinazione regioni del genoma umano con efficienze simili ai nostri studi iniziali in lievito. Ora, questo nuovo protocollo ottimizzato permette l’adattamento e l’utilizzo della tecnologia per interrogare le interazioni proteina-DNA in tutto il genoma umano, utilizzando la spettrometria di massa o altri approcci analitici.
È importante sottolineare che il metodo di HyCCAPP è destinato per l’analisi delle regioni di destinazione specifico e non è ancora adatto per le analisi del genoma. La tecnologia è particolarmente utile quando si tratta di regioni per le quali c’è scarse informazioni sulle proteine interagenti, o quando si desidera un’analisi più completa e approfondita delle proteine d’interazione in un locus specifico genoma. HyCCAPP è destinato a scoprire proteine che legano il DNA ma non caratterizzare accuratamente i siti di legame della proteina specifica in DNA genomic. Nell’implementazione corrente, la metodologia non fornisce informazioni circa il grippaggio del DNA sequenze o motivi per singole proteine. Pertanto, ben integra le tecnologie esistenti quali FAIRE e possono consentire l’identificazione delle proteine leganti in regioni genomiche identificato da una prima analisi FAIRE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di HyCCAPP qui descritto ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente approccio per scoprire interazioni DNA che altrimenti rimarrebbero sfuggente. La natura del processo dà HyCCAPP la flessibilità di lavorare in diversi organismi e regioni del genoma. Si tratta di un metodo, tuttavia, che ha diverse limitazioni da considerare.
HyCCAPP è un metodo che evita eventuali modifiche di cella in modo che potenzialmente può essere applicato in cellule primarie, sistemi di co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni P50HG004952 e R01GM109099 a MO.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
Riferimenti
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