Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción
Summary
Las moléculas de ADN para microscopía de fluorescencia de la tinción permite ver durante un experimento científico. En el método presentado aquí, las moléculas de ADN son previamente teñidas con colorantes fluorescentes y digeridas con metilación y enzimas de restricción sensibles no metilación.
Abstract
Visualización del ADN para microscopía de fluorescencia utiliza una variedad de tintes tales como los colorantes de Cianina. Estos colorantes son utilizados debido a su alta afinidad y sensibilidad para el ADN. Para determinar si las moléculas de ADN son completas después de la terminación del experimento, se requiere un método para determinar si las moléculas de tinción son longitud total por digestión de DNA con enzimas de restricción. Sin embargo, DNA manchada puede inhibir las enzimas, por lo que es necesario un método para determinar qué enzimas se puede usar para el fluorocromo mancharon ADN. En este método, el ADN se tiñe con un tinte de Cianina durante la noche para permitir que el tinte y el ADN se equilibren. Siguiente, tiñe ADN es digerido con una enzima de restricción, cargan en un gel y al. Las bandas de digestión de ADN experimentales son comparadas a una digestión en silico para determinar la actividad de la enzima de la restricción. Si hay el mismo número de bandas, como era de esperar, la reacción es completa. Bandas más de lo esperado indica la digestión parcial y menos bandas indican digestión incompleta. La ventaja de este método es su simplicidad y utiliza equipos que un científico necesita de una enzima de la restricción análisis y electrophoresis del gel. Una limitación de este método es que las enzimas disponibles para la mayoría de los científicos son las enzimas comercialmente disponibles; sin embargo, podría utilizarse cualquier enzimas de restricción.
Introduction
La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3 y BOBO-3; Tabla 1) se utiliza en una amplia variedad de experimentos donde la visualización de ADN es necesario1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la familia de dímeros de Cianina es ampliamente utilizada debido a su alta afinidad por las moléculas de ADN18,19,20, rendimiento cuántico y sensibilidad. Colorantes de Cianina dímero tienen gran selectividad para la DNA trenzada doble y cuando se intercalan un aumento de 100 a 1000 veces mayor de fluorescencia21. Tintes de pyridinium (YOYO-1, TOTO-1, 3 YOYO y TOTO-3) tienen una menor longitud de onda emisión de su quinolium del tinte (BOBO-1, 1 POPO, BOBO-3 y POPO 3) contrapartes (tabla 1)22. También, la producción de quántum de dímeros de Cianina intercalada en el ADN es alta (0.2 – 0.6)22. Sin embargo, utilizando una enzima para determinar el perfil de metilación de ADN molécula2 o estiramiento23 de una molécula de ADN ya teñida con colorante fluorescente requiere de un método para determinar qué enzimas digieren DNA manchada. Cualquier tipo de colorante que se intercala en el ADN o cualquier enzima que da un patrón discernible del sustrato de ADN se puede utilizar para este método.
Meng et al. en primer lugar determina la tasa de digestión de prestained ADN mediante electroforesis en gel utilizando una variedad de diferentes tintes24. Maschmann et al. profundizó en más profunda para ver a la familia TOTO de tintes. Ambos determinan la tasa de digestión de DNA manchada para ver si ADN teñida con un colorante determinado podría ser digerido con una enzima de la restricción de25. Otros métodos de estudian efectos vinculantes de tintes intercalados con el ADN usando pinzas ópticas26 o27de NMR. Cualquiera de los métodos requiere de equipo especializado; Considerando que este método permite el equipo que más laboratorios de biología molecular para determinar si un tinte interfiere con una enzima de la restricción digestión.
Además, en otros métodos para medir la longitud de una molécula dada, mapeo óptico ha alargado sin manchas las moléculas de ADN sobre una superficie y digiere ADN para determinar la extensión y tamaño de los fragmentos. Intercalación de tinte se ha demostrado para aumentar la longitud del contorno de las moléculas de ADN fluorescente manchadas y dependiendo del colorante utilizado, los contorno son diferentes21. Este método ha sido utilizado en una variedad de genomas1,3,4,6,13,28,29,30, 31. sin embargo, si las moléculas previamente teñidas, dependiendo del tinte y la enzima, la enzima puede no poder cortar ADN teñida con un colorante determinado. Por lo tanto, este método determina si ADN teñida con un colorante determinado puede ser digerido con una enzima. Además, dependiendo de la concentración de la tintura y el tinte utilizado, la movilidad de la DNA bandas en un gel migrarán más lentamente que el ADN nativo debido a la corrección parcial de la espina dorsal de la DNA para el tinte insertar entre pares de bases32 .
Sin embargo, a veces estos tintes pueden parcialmente o inhiben totalmente la acción de ciertas enzimas de restricción7,24. Esto es probablemente debido a un cambio estructural en el ADN causado por la fijación del colorante fluorescente, que puede impedir que la enzima reconoce la secuencia específica. Entender cómo estos tintes afectan enzimas de restricción puede ayudar en experimentos donde se requiere el perfil de metilación o el tramo de ADN teñido.
En nuestro método, ADN fue teñido con un fluorocromo de interés y digerido con una enzima de restricción. Luego fue electrophoresed DNA en un gel, reflejado, y se midió la tasa de digestión de la enzima de la restricción. Las enzimas de restricción fueron elegidas basándose en el patrón de corte en un gel. Superposición de bandas de ADN causadas muchas y muy pocas bandas no dio una imagen completa de la molécula de ADN. Hay un punto dulce para poder determinar el perfil de la molécula de ADN digerido; por lo tanto, dependerá de la DNA usada y la enzima. Una ventaja de este método es su simplicidad; sólo requiere equipo usado en una electroforesis de gel y digestión de restricción.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para digerir el ADN etiquetado fluorescente (figura 1), se requieren una serie de pasos. En primer lugar, ADN se tiñe con un fluorocromo durante la noche. ADN puede incubarse con dímeros de Cianina por un período más corto de tiempo; sin embargo, Carlsson et al encontraron que ADN creado bandas doble para cada tamaño de ADN debido a la tinción incompleta20. Para remediar esto, el ADN puede mancharse durante la noche para evitar que band…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional para el General médico Ciencia (NIGMS) (5605100122001), un componente de los institutos nacionales de salud (NIH), así como la Universidad de Nebraska en Kearney (UNK) verano estudiante investigación programa (SSRP) y UNK Beca de pregrado (URF).
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
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