استكشاف أدوار القوى المادية في أوائل Morphogenesis الجنينية الفرخ
Summary
نقدم هنا، بروتوكول بإدخال مجموعة من تجارب السابقين-ovo جديدة ونهج النمذجة الفيزيائية لدراسة آليات morphogenesis خلال أوائل التواء الدماغ الجنينية الفرخ.
Abstract
دراسة التطور الجنيني تقليديا من منظور علم الوراثة الجزيئية البيولوجية، ولكن أصبح يتزايد الاعتراف بالأهمية الأساسية للميكانيكا في morphogenesis. على وجه الخصوص، أنبوب القلب والمخ الفرخ الجنينية، التي تخضع لتغيرات جذرية المورفولوجية كما أنها تضع، من بين المرشحين رئيس الوزراء لدراسة دور القوى المادية في morphogenesis. الانحناء البطني التدريجي واليمين من التواء الدماغ أنبوبي الفرخ الجنينية يحدث في مرحلة مبكرة من مستوى الجهاز اليسار واليمين التفاوت في التنمية الجنينية الفرخ. غشاء فيتيلين (VM) يقيد الجهة الظهرية للجنين، وقد تورط في توفير القوة اللازمة للحث على التواء الدماغ النامي. نقدم هنا مجموعة من تجارب السابقين-ovo جديدة والمادية والنمذجة لتحديد آليات لالتواء الدماغ. في المرحلة 11 من همبرغر-هاملتون، يتم حصاد الأجنة ومثقف ex ovo (في وسائل الإعلام). بعد إزالة VM باستخدام أنبوب شعري سحبت. بالتحكم في مستوى السائل وتعريض الجنين إلى واجهة الهواء السائل، يمكن استخدام السوائل التوتر السطحي لوسائط الإعلام ليحل محل دور الميكانيكية للجهاز الظاهري. كما أجريت تجارب الجراحة الدقيقة لتغيير موضع القلب للبحث عن التغيير الناتجة في عدم التواء الدماغ. وتوضح النتائج من هذا البروتوكول الأدوار الأساسية للميكانيكا في القيادة morphogenesis.
Introduction
بحوث علم الأحياء التنموي الحديث تركز إلى حد كبير على فهم التنمية من منظور علم الوراثة الجزيئي1،2،3،4،،من56 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-ومن المعروف أن الظواهر الفيزيائية التي تلعب دوراً محوريا في morphogenesis، أو توليد البيولوجية تشكل14،15،،من1617؛ ومع ذلك، تظل آليات ميكانيكية محددة للتنمية تحظ. فليشر البطني واليمين من التواء الأنبوب الدماغ البدائية بعد همبرغر-هاميلتون المرحلة 11 (سمو 11)18 العمليتين الرئيسية التي تسهم في الشكل الجنينية تغيير19،20. على وجه الخصوص، ولا تزال إليه المادية التي تقوم عليها التنمية اﻻلتوائية في الدماغ الجنينية مفهومة.
التواء الجنينية في الجنين فرخ من بين أقرب الأحداث مورفوجينيتيك من اليسار واليمين (L-R) التفاوت في التنمية. عندما تشعر بالقلق عملية اللاتماثل L-R، تحدث العيوب الخلقية مثل وجود مكان إينفيرسوسأو تصاوغ هيتيروتاكسيا 21.
وهنا يقدم بروتوكول الذي يجمع بين تجارب السابقين-ovo ،من2223 مع النمذجة الفيزيائية لتوصيف قوي ميكانيكية أثناء تطور الدماغ الجنينية المبكرة. هو هدف طريقة عرض تحديد القوى الميكانيكية مسؤولة عن التواء الدماغ والعوامل التي تؤثر على درجة التواء خلال وقت مبكر التنمية12. وبناء على الملاحظة التجريبية أن الغشاء فيتيلين (VM) يحد من الجهة الظهرية للجنين، افترضنا أن VM توفر القوة اللازمة للحث على التواء الدماغ النامي. ولذلك، في هذا الأسلوب، ازلنا الجزء من الجهاز الظاهري الذي يغطي منطقة الدماغ لمعرفة آثار على التواء الدماغ. وعلاوة على ذلك، استخدمت طريقة تطبيق التوتر السطحي السوائل لتأكيد دور VM الميكانيكية وتقديم تقدير القوة اللازمة لالتواء الدماغ، التي لم يتم مسبقاً. قياس القوى أثناء morphogenesis الجنينية مهمة صعبة. جدير بالذكر أن وضع Campàs وزملاء العمل24 في دراسة رائدة، طريقة جديدة لقياس الخلوية وتشدد على استخدام حقن ميكرودروبليتس. ومع ذلك، هذا الأسلوب كانت محدودة لقياس القوى على المستوى الخلوي، ومن ثم لا ينطبق على التحقيق في القوات على مستوى الأنسجة أو الكائن الحي. ووضع البروتوكول المعروضة في هذه الورقة جزئيا في سد هذه الفجوة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما الظواهر الفيزيائية تلعب دوراً أساسيا في morphogenesis26،27،28،،من2930، الآليات الميكانيكية المحددة، جنبا إلى جنب مع التنسيق بين الميكانيكية و الآليات الجزيئية، ما زالت غير مستكشفة إلى حد كبير. ومن المع?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z.C. تعترف بالدعم من الصندوق بدء التشغيل دارتموث وبرانكو فايس-جمعية زمالة العلوم، يديرها زيوريخ ETH. يشكر المؤلفون الدكتور لاري أ Taber، Benjamen أ فيلاس، قوة كيونج، ويونفي شي لإجراء مناقشات مفيدة، فضلا عن المراجعين المجهول للتعليقات. هذه المواد ويستند إلى العمل المدعوم من “زمالة البحوث الدراسات العليا مؤسسة العلوم الوطنية” تحت “رقم المنحة” DGE-1313911. أي رأي، النتائج التي توصل إليها، والاستنتاجات أو التوصيات التي أعرب عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين (s)، ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر “المؤسسة الوطنية للعلوم”.
Materials
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
Riferimenti
- Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
- Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).
- Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476, 57-62 (2011).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).
- Shyer, A. E., et al. Villification: how the gut gets its villi. Science. 342, 212-218 (2013).
- Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).
- Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. Tunable helical ribbons. Appl. Phys. Lett. 98, (2011).
- Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. How the cucumber tendril coils and overwinds. Science. 337, 1087-1091 (2012).
- Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods. Science. 333, 1726-1730 (2011).
- Filas, B. A., et al. A potential role for differential contractility in early brain development and evolution. Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).
- Xu, G., et al. Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding. J. Biomech. Eng. 132, 71013 (2010).
- Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. How the embryonic chick brain twists. J. R. Soc. Interface. 13, (2016).
- Manca, A., et al. Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).
- Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a. Bending of the looping heart: differential growth revisited. J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).
- Shi, Y., et al. Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry. Front. Physiol. 5, (2014).
- Taber, L. A. Morphomechanics: Transforming tubes into organs. Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).
- Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo. J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).
- Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a. Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?. Phys. Biol. 12, 16012 (2015).
- Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).
- Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos. Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).
- Chuai, M., Weijer, C. J. The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo. Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).
- Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo. Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).
- Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces. Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).
- Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting. Phys. Rev. Appl. 5, (2016).
- Manner, J., Seidl, W., Steding, G. Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos. Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).
- Ware, M., Schubert, F. R. Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo. J. Anat. 219, 203-216 (2011).
- Ramasubramanian, A., et al. On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping. Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).
- Hoyle, C., Brown, N. a., Wolpert, L. Development of left/right handedness in the chick heart. Development. 115, 1071-1078 (1992).
- Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads. Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).
- Levin, M. Left-right asymmetry and the chick embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Peebles, D. M., et al. Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo. Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).
- Zhu, L., et al. Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart. Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).
