Sondering roller af fysiske kræfter i tidlige Chick embryonale morfogenese
Summary
Vi præsenterer her, en protokol, at indføre en række nye ex-ovo eksperimenter og fysiske modellering tilgange til at studere mekanikken i morfogenese under tidlige chick embryonale hjernen torsion.
Abstract
Fosterudviklingen er traditionelt studerede fra perspektivet af Biomolekylær genetik, men den grundlæggende betydning af mekanik i morfogenese er ved at blive stadig mere anerkendt. Især embryonale chick hjerte og hjerne tube, som undergår drastiske morfologiske ændringer, som de udvikler, er blandt de vigtigste kandidater til at studere fysiske kræfter i morfogenese rolle. Progressive ventrale bøjning og højredrejningen torsion af rørformede embryonale chick hjernen ske på det tidligste stadium af orgel-niveau højre-asymmetri i chick embryonale udvikling. Den vitelline membran (VM) begrænser den dorsale side af fosteret og har været impliceret i leverer den kraft, der er nødvendig for at fremkalde torsion af udvikle hjernen. Her præsenterer vi en kombination af nye ex-ovo eksperimenter og fysiske modellering for at identificere mekanikken i hjernen torsion. På Hamburger-Hamilton Stadium 11, embryoner er høstet og kulturperler ex ovo (i medierne). VM fjernes efterfølgende ved hjælp af en trak kapillarrør. Ved at kontrollere niveauet af væske og underkaste embryonet et væske-air interface, kan flydende overfladespænding medier bruges til at erstatte den mekaniske rolle af VM. Mikrokirurgi eksperimenter blev også udført for at ændre placeringen af hjertet for at finde den deraf følgende ændring i chiralitet af hjernen torsion. Resultaterne fra denne protokol illustrere mekanik i kørsel morfogenese grundlæggende roller.
Introduction
Moderne udviklingsmæssige biologi forskning fokuserer i høj grad på forståelse udvikling fra perspektivet af molekylær genetik1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. det er kendt at fysiske fænomener spiller en central rolle i morfogenese, eller generation af biologiske danne14,15,16,17; særlige mekaniske mekanismer af udviklingen er dog stadig i vid udstrækning unstudied. Ventrale flexure og højredrejningen torsion af den primitive hjerne tube efter Hamburger-Hamilton etape 11 (HH 11)18 , er de to vigtigste processer, der bidrager til embryonale form ændre19,20. Navnlig, forbliver fysisk mekanismen underliggende torsionsstivhed udviklingen i embryonale hjernen utilstrækkeligt forstået.
Den embryonale torsion i kylling embryo er blandt de tidligste morfogenetiske begivenheder af venstre-højre (L-R) asymmetri i udvikling. Når processen med L-R asymmetri er desorienterede, vil fosterskader situs inversus, isomerieller heterotaxia forekomme21.
Her præsenterer vi en protokol, som kombinerer ex-ovo eksperimenter22,23 med fysisk modellering at karakterisere mekaniske kræfter i den tidlige embryonale hjerne udvikling. Målet med metoden præsenteret er at identificere de mekaniske kræfter ansvarlig for hjernen torsion og de faktorer, der påvirker graden af torsion under tidlige udvikling12. Baseret på eksperimentel observation at vitelline membranen (VM) begrænser den dorsale side af embryonet, hypotese vi at VM giver den kraft, der er nødvendig for at fremkalde torsion af udvikle hjernen. Derfor i denne metode, vi har fjernet del af VM, der dækker området hjernen til at finde ud af, virkningerne på hjerne torsion. Derudover blev metode til at anvende flydende overfladespænding brugt til at bekræfte den mekaniske rolle af VM og give et skøn over den kraft, der er nødvendig for hjerne vride, som ikke havde været gjort tidligere. Måling af kræfter under embryonale morfogenese er en udfordrende opgave. Navnlig i en banebrydende undersøgelse udviklet Campàs og co-arbejdere24 en roman metode til at kvantificere de cellulære belastninger ved hjælp af injiceres microdroplets. Ikke desto mindre, denne metode var begrænset til at måle kræfter på cellulært niveau, derfor ikke relevant at sonde styrker på væv – eller organisme-niveau. Den protokol, der præsenteres i dette dokument blev udviklet delvis udfylde hullet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens fysiske fænomener spiller en integrerende rolle i morfogenese26,27,28,29,30, de særlige mekaniske mekanismer, samt koordinering af mekaniske og molekylære mekanismer, forbliver stort set uudforskede. Det vides at den ventrale flexure og højredrejningen torsion af den primitive hjerne er to centrale processer, der bidrager til tidlig embryonale morfoge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z.C. anerkender støtte fra Dartmouth start fond og Branco Weiss – Society for videnskab fellowship, administreret af ETH Zürich. Forfatterne takke Drs. Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo, og Yunfei Shi for nyttige diskussioner, såvel som de anonyme korrekturlæsere for kommentarer. Dette materiale er baseret på arbejde støttes af de National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant nr. DGE-1313911. Enhver udtalelse, konstateringer og konklusioner og henstillinger udtrykt i dette materiale er dem af forfatterne (s) og afspejler ikke nødvendigvis synspunkter af National Science Foundation.
Materials
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
Riferimenti
- Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
- Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).
- Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476, 57-62 (2011).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).
- Shyer, A. E., et al. Villification: how the gut gets its villi. Science. 342, 212-218 (2013).
- Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).
- Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. Tunable helical ribbons. Appl. Phys. Lett. 98, (2011).
- Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. How the cucumber tendril coils and overwinds. Science. 337, 1087-1091 (2012).
- Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods. Science. 333, 1726-1730 (2011).
- Filas, B. A., et al. A potential role for differential contractility in early brain development and evolution. Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).
- Xu, G., et al. Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding. J. Biomech. Eng. 132, 71013 (2010).
- Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. How the embryonic chick brain twists. J. R. Soc. Interface. 13, (2016).
- Manca, A., et al. Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).
- Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a. Bending of the looping heart: differential growth revisited. J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).
- Shi, Y., et al. Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry. Front. Physiol. 5, (2014).
- Taber, L. A. Morphomechanics: Transforming tubes into organs. Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).
- Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo. J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).
- Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a. Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?. Phys. Biol. 12, 16012 (2015).
- Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).
- Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos. Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).
- Chuai, M., Weijer, C. J. The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo. Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).
- Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo. Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).
- Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces. Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).
- Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting. Phys. Rev. Appl. 5, (2016).
- Manner, J., Seidl, W., Steding, G. Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos. Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).
- Ware, M., Schubert, F. R. Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo. J. Anat. 219, 203-216 (2011).
- Ramasubramanian, A., et al. On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping. Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).
- Hoyle, C., Brown, N. a., Wolpert, L. Development of left/right handedness in the chick heart. Development. 115, 1071-1078 (1992).
- Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads. Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).
- Levin, M. Left-right asymmetry and the chick embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Peebles, D. M., et al. Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo. Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).
- Zhu, L., et al. Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart. Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).
