Burada tarif biz miktar histolojik bölümlerde boyama Gomori’nın değiştirilmiş methanamine gümüş tarafından invazif aspergillosis ile farelerde akciğer mantar yükünü belirlemek için bir iletişim kuralı. Bu yöntemin kullanılması için mantar yükünün değerlendirmesi akciğer mantar DNA kantitatif PCR ile karşılaştırıldığında daha az hayvan ile karşılaştırılabilir sonuçlarında sonuçlandı.
Akciğer mantar yükünün miktar göreli düzeyde bağışıklık koruma ve fare modelleri akciğer mantar enfeksiyonu, mantar virülans belirlenmesi için önemlidir. Birden çok yöntem mantar yük değerlendirmek için kullanılmasına rağmen nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) Mantar DNA’ın bir teknik önceki kültür tabanlı yöntemleri çeşitli avantajlar ile ortaya çıkmıştır. Şu anda, kapsamlı bir değerlendirme akciğer patoloji, lökosit işe alım, mantar yük ve gen ekspresyonu ile invazif aspergillosis (IA) farelerde deneysel önemli sayıda ve denetim hayvanlar kullanımını gerektirir. Burada akciğer mantar yük hayvanları azaltılmış bir dizi kullanarak belirlemek için boyama histolojik miktar ayrıntılı olarak incelenmiştir. Akciğer bölümleri boyama mantar yapıları ile Gomori’nın değiştirilmiş methanamine gümüş (GMS) tanımlamak için lekeli. Görüntüleri GMS lekeli bölümlerini her formalin sabit parafin gömülü akciğer 4 ayrı alanlarda alındı. Her görüntü içindeki alanların lekeli GMS bir görüntü analiz programı kullanarak sayısal ve bu miktar ortalama yüzdesini lekeli alan her örnek için tespit edildi. IA ile vahşi tipi fareler caspofungin ile geliştirmek değil iken bu stratejiyi kullanarak, eozinofil eksikliği fareler sergilenen mantar yük ve hastalığı caspofungin terapisiyle azalmıştır. Benzer şekilde, mantar yük farelerde γδ T hücreleri eksik da bir gelişme caspofungin tarafından qPCR ve GMS miktar tarafından ölçülen. GMS miktar bu nedenle sonuçta deneysel hayvan invazif aspergillosis kapsamlı çalışmalar için gerekli miktarı azaltabilir, göreli akciğer mantar yükünün belirlenmesi için bir yöntemi olarak tanıttı.
IA konjenital veya edinsel bağışıklık eksiklikleri nedeniyle immün süpresif tedavi veya kronik enfeksiyon1,2ile duyarlı bireylerde gelişebilir bir fırsatçı enfeksiyon var. Birincil enfeksiyonu genelde akciğerlerde, bazı örnekleri yayılması Aspergillus fumigatus rağmen karaciğer, böbrekler, kalp için ortaya çıkan ve ağır hastalıklar ve yüksek eşliğinde hif geniş doku işgali kaynaklanan beyin oluşabilir oranları ölüm1,2. Ayrıca, varolan sağaltımı etkinliği sınırlıdır ve daha fazla çevre3antifungal dirençli suşların ortaya çıkması tarafından zayıflamış. Bu nedenle gelişmesini teşvik mekanizmaları mantar virülans ve ana patoloji veya alevlenmesi invazif mantar hastalığı anlamak önemlidir.
Araştırmacılar mantar virülans genlerin rol değerlendirmek ve kuruluş ve gelişmesi A. fumigatus içinde vivo4,5için bağışıklık effectors ev sahibi izin olarak fare modelleri mekanik IA çalışmaları için önemli kalır. Sonuç olarak, çoklu stratejiler etkili bir şekilde ölçmek veya mantar yükünü gruplar halinde deneysel hayvan6,7karşılaştırmak için taktığı. Bu stratejileri kültür tabanlı, biyokimyasal, immunoassay veya qPCR yöntemleri, her biri farklı avantajları ve dezavantajları dahil. Ayrıca, bu yöntemlerin her biri bir alt hayvanlar için bağışıklık efektör işlevi, gen ifade analizi ve karşılaştırmalı histopatoloji7değerlendirme feda ek olarak özveri gerektirir. Böylece, kapsamlı IA çalışmalar genellikle önemli bir maliyetle araştırma hayvanların önemli sayıda gerektirir. Deneysel zaman, hayvan maliyeti ve etik kaygılar birden çok analizleri için hayvan dokuları kullanarak azaltmak etkili stratejiler bu nedenle son derece değerli7vardır.
Bu raporda, farelerin IA ile deneysel grupları arasında göreli mantar yükünün histolojik bölümlerde karşılaştırma için boyama GMS miktar bir yöntem tanıttı. Mantar kültürü her adımından enfeksiyon, doku hasat ve işleme ve resim alma ve veri analizi, ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Mantar yükleri GMS miktar tarafından elde edilen qPCR Nötropenik modelleri Ia ve IA8ile vahşi-türü veya eozinofil eksikliği fareler caspofungin tedavi ile karşılaştırıldı. Sonuçlar GMS miktar ve mantar DNA’ın qPCR ile benzerlik gösterir. Bu GMS miktar karşılaştırma IA ile farelerde göreli mantar yükünün tamamlayıcı ya da alternatif bir yöntem olarak histolojik analizler yapan araştırmacılar için yararlı olabilir ve sonuçta araştırma hayvanlarda kullanımı ve maliyetini azaltabilir göstermektedir karmaşık, mekanik çalışmalar.
Bu makalenin amacı, IA ile farelerde akciğer mantar yükünün belirlenmesi için bir yöntem görüntü analizi ve miktar GMS lekeli akciğer histolojik bölümleri kullanarak tanıtmak oldu. Bu çalışmada, tedavi ile beta-glukan-sentez-hedefleme antifungal ilaç caspofungin14 hayatta kalma ya da mantar yük IA8ile Nötropenik vahşi tipi farelerde geliştirmek mi değil. Ancak, eozinofil veya γδ T hücreleri yokluğunda, hayatta kalma ve mantar yük geliştirilmiş. Bizim çalışmanın sonuçlarını da benzer sonuçlar GMS mantar yük yaygın olarak kullanılan mantar DNA qPCR yöntem6ile karşılaştırıldığında elde gösterdi.
GMS mantar yük miktar kullanmak için birçok faydası vardır. İlk olarak, işlem varolan histolojik örnekleri, böylece potansiyel olarak deneyler önemli farkları belirlemek için gerekli sayısını azaltarak kullanabilir. İkinci olarak, bu çalışmada, daha az hayvan GMS mantar yük miktar qPCR mantar DNA (şekil 6, Şekil 7) göre önemli farklılıklar elde etmek için gerekli idi. Üçüncü olarak, karşılaştırma qPCR tarafından farklı yalıtır mantar yükünün ribozomal DNA kopyalama sayı15farklılıkları izole bağımlı tarafından etkilenebilir. Buna ek olarak, mantar yük akciğer mantar büyüme göreli düzeyleri tarafından belirlendiği şekilde GMS miktar kopya numarası tarafından etkilenmez. Böylece, mantar yük için GMS miktar kullanımını omurgalı hayvanlar kullanımını azaltır ve öncesi rDNA kopya numarası tayini gerektirmez. Son olarak, üstelik fungal Morfoloji değiştirebilirsiniz, caspofungin terapi mantar parçalanma artırır ve böylece yapay akciğer homogenates12,16 koloni oluşturan birimlerin yalıtım tarafından ölçülen zaman mantar yükü artırabilir ,17. Böylece, GMS miktar mantar yükünün diğer sık kullanılan yöntemler ile bazı sınırlamaları doğasında önler.
Ancak, GMS miktar ve/veya bu çalışma sınırlamaları unutmayın. İlk olarak, yazarlar her deney grubu hyphal büyüme akciğerlere boyunca karşılaştırılabilir bir dağıtım kabul ve böylece miktar 4 temsilcisi 10 üzerinden tüm akciğer mantar yük için temsili bir ölçüyü objektif alanlar kullanılmış (Şekil 6B). Mantar yük qPCR yöntemi tarafından bu yöntem ve eşdeğer ile farklı görünür böylece bazı durumlarda göreli dağıtım, boyutu ve yoğunluğu hyphal foci yeterince farklı olacaktır ki mümkündür. Ancak, ek sonuçlarımız 4 X objektif alanları kullanarak tüm akciğer bölümüne miktar ile daha az gruplar (şekil 6C) arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olsa benzer, gösterdi. Bu miktar standart hatası büyük olasılıkla nedeniyle azalmış hyphal çözünürlük 4 X amaç ve artan arka planda suboptimal alanları ile bu strateji ile artış olmuştur. Bu nedenle, daha az alan yüksek büyütmede temsilcisi bir miktar tercih edilir. İkinci olarak, yalnızca bir tek, Merkezi bölümü her örnek için kullanıldı. Mümkün, mantar yalıtır dayalı veya fareler suşları kullanıldığında, bazı çalışmalarda hyphal büyüme düzensiz bir dağılım içinde neden olabilir. Bu durumlarda, ek bölümleri her parafin blok boyunca daha temsili bir yük almak için sayısal. Üçüncü olarak, (Yani, sayısal hava yolu mantar büyüme Alerjik Bronkopulmoner aspergilloz (Hastalarını)18 veya Kistik fibrozis (CF)18), mucins GMS reaktivite ile önemli üretimini teşvik deneylerde polisakkarit zengini mucins19 non-spesifik GMS + sonuçlar ve böylece daha yüksek mantar yük lehine bazı örnekler çarpık. Sadece Nötropenik model IA bu çalışmada kullanılan bu yana, diğer bağışıklık baskılayıcı veya yetkili modellerinin kullanımı sonuçlarında az karşılaştırılabilir sonuçlar olabilir mümkündür. Bu uyarılar rağmen GMS miktar mantar yükünü belirlemek için karşılaştırılabilir bir tekniği sağlar ve sürekli kullanımı ile ek çalışmalar daha da tutarlı, güvenilir ve düşük maliyetli olarak bu yöntemin yarar doğrulamak.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada kısmen tarafından bir Indiana Üniversitesi okul tıp araştırma geliştirme Grant’ın ve NIH NIAID 1R03AI122127-01 tarafından desteklenmiştir. N.A. kısmen bu dönemde İmmünoloji bursu bir kariyer üzerinden Immunologists Amerikan Derneği tarafından desteklenmiştir.
Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |