Um sistema de Microbiomechanical para estudar a formação de varizes e a recuperação no axônio do neurônio Central
Summary
Este protocolo descreve uma abordagem fluida pressurizada, fisiologicamente relevante para a indução rápida e reversível de varizes nos neurônios.
Abstract
Varizes axonal são estruturas alargadas dos poços de axônios com um alto grau de heterogeneidade. Eles estão presentes não só no cérebro com doenças neurodegenerativas ou ferimentos, mas também no cérebro normal. Aqui, descrevemos um sistema recém-criada Micromecânico para rápida, confiável e reversível induzir axonal varicosidades, permitindo-na compreender os mecanismos que regem a formação de varizes e composição de proteínas heterogêneas. Este sistema representa um romance meio para avaliar os efeitos do estresse de compressão e cisalhamento em diferentes compartimentos subcellular de neurônios, diferentes de outros sistemas em vitro que concentram-se principalmente sobre o efeito de alongamento. Importante, devido as características únicas do nosso sistema, recentemente fizemos uma descoberta romance, mostrando que a aplicação do fluido pressurizado pode rapidamente e reversivelmente induzir varicosidades axonal através da ativação de um canal potencial transiente do receptor. Nosso sistema biomecânico pode ser utilizado convenientemente em combinação com perfusão de drogas, célula viva de imagem, imagem de cálcio e gravação de braçadeira do remendo. Portanto, esse método pode ser adotado para o estudo de canais de íon mechanosensitive, regulamento de transporte axonal, dinâmica do citoesqueleto axonal, sinalização de cálcio e alterações morfológicas relacionados ao traumatismo crânio-encefálico.
Introduction
Formação de varizes ou inchaço/perolização, ao longo do axônio, é uma característica proeminente de neurodegeneração observada em muitos distúrbios ou lesões do sistema nervoso central, incluindo esclerose múltipla, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e traumáticas 1,de lesão cerebral2. Apesar dos impactos fisiológicos significativos de varicosidades axonal na propagação do potencial de ação e transmissão sináptica3, como as varizes são geradas permanece desconhecida. Recentemente, usando um ensaio microbiomechanical recém-criada em neurônios hippocampal culturas de roedores, descobrimos que estímulos mecânicos podem induzir as varizes nestes neurônios com altamente intrigante características. Em primeiro lugar, a indução de varizes é rápida (< 10 s) e este processo é reversível inesperadamente. Em segundo lugar, a iniciação de varizes depende da força de pressão de sopro: quanto maior a pressão, mais rápido a iniciação. Em terceiro lugar, iniciação de varizes depende de idade neuronal. Os axônios dos neurônios jovens aparecem mais sensíveis ao estresse mecânico, comparado dos neurônios mais velhos. Em quarto lugar, a forma das varizes ao longo dos axônios dos neurônios hippocampal, enquanto as dendrites e segmentos do axônio inicial destes neurônios não exibir nenhuma mudança sob a mesma condição de sopro. Assim, nosso estudo revelou uma característica nova da polaridade neuronal. Esses achados com o sistema in vitro são fisiologicamente relevantes. Usando um modelo in vivo para leve traumatismo crânio-encefálico (mTBI), mostramos que as varizes axonal desenvolveram de forma multi focal no córtex somatossensorial dos ratos imediatamente após fechar-crânio impacto, consistente com o nosso em vitro resultados4. É importante notar que nossa coloração e da imagem latente dos ratos mTBI fornecem apenas um snap shot de alterações morfológicas neuronais, desde executar na vivo imagem de lapso de tempo da morfologia neuronal durante um impacto mecânico é ainda não é viável.
Este sistema de fluido-sopro nos permitiu não só para capturar características únicas associadas com a formação de varizes induzida por estresse mecânico, mas também para determinar o mecanismo subjacente. Ao testar diferentes soluções extracelulares, os bloqueadores e abridores de candidatos diferentes de canais de íon mechanosensitive e Eletrofisiologia celular, identificamos que o cátion potencial transiente do receptor canal membro da subfamília V 4 (TRPV4) canal permeável ao Ca2 + e at+ e ativada pelo sopro é principalmente responsável pela detecção de estresse mecânico inicial durante a formação de varizes axonal4. Isto foi confirmado ainda mais com uma abordagem de nocaute de siRNA. Tomados em conjunto, este novo sistema de ensaio, que temos desenvolvido com cultura de neurônio hippocampal, é altamente valiosa para estudar as propriedades micromecânicas de neurônios centrais, especialmente em combinação com outras técnicas.
Este sistema Micromecânico estabelecemos é único e difere dos sistemas existentes anteriormente em vários aspectos importantes. Em primeiro lugar, neste sistema, os neurônios experimentam fora-do-avião estresse mecânico nas formas de compressão e cisalhamento. Durante o impacto mecânico, processos neuronais ficar aderente à superfície da lamela e não se mexa. Isto difere de outros sistemas que envolveu principalmente flexão e alongamento no plano experimental (ou tensão), por exemplo, a deflexão de axônios empacotados como movendo sequências de caracteres de5,6 ou alongamento axônios cultivados em micropatterned canais e membranas stretchable7,8. Além disso, embora as varizes axonal podem também ser induzidas nestes ensaios como no nosso sistema de fluido-sopro, o processo nessas configurações leva muito mais tempo (a partir de 10 min para várias horas6,7,8) e aparece irreversível. Finalmente, o nosso sistema usando o sopro fluido local permite o exame das características espaciais da formação de varizes (EG., dendrites, espinhas dendríticas, soma, segmentos iniciais axonal, terminais axonal), além de suas características temporais. Usando este sistema, descobrimos vários recursos inesperados e exclusivos de formação de varizes axonal, especialmente rápido início lenta reversibilidade e polaridade do axônio-dendrito.
O sistema que discutimos neste trabalho é compatível com muitas técnicas de molecular e biologia da pilha. Por exemplo, para estudar os efeitos do estresse mecânico na morfologia neuronal e função, pode ser usada em conjunto com coculture de mielina, lapso de tempo por imagem da transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET) e reflexão interna total da fluorescência (TIRF), imagem de cálcio e gravação de braçadeira do remendo. Neste trabalho, focalizamos os componentes do núcleo do sistema. Cultura de neurônio hippocampal, o fluido-sopro de instalação, de alta resolução de imagem de lapso de tempo para o transporte axonal e imagem de cálcio são ilustradas passo a passo abaixo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O procedimento de ensaio este microbiomechanical é para a frente. Produzirá resultados fiáveis, se todos os seus passos são cuidadosamente realizados. Existem várias etapas-chave que, se incorrectamente executados, vão dificultar a coleta de dados bem sucedida. Os passos críticos começam a montante da aplicação real do sopro estímulo. Dissecção cuidadosa, cultivo e cuidados da cultura neurônio primário são primordiais. Se os neurônios cultivados não são saudáveis, não reagirão consistentemente, desd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os institutos nacionais de Saúde Animal uso orientações. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do National Institutes of Health (R01NS093073 e R21AA024873) para C. Gu.
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
Riferimenti
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